HSP70調(diào)控雷帕霉素對(duì)鼻咽癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用分子機(jī)制研究.pdf

1、鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma,NPC)是我國(guó)南方常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,發(fā)病率為10～50/10萬(wàn)人口,死亡率在全身惡性腫瘤中的比例,全國(guó)第八,兩廣居第三位。目前該病的治療仍然以放射治療為主。對(duì)放療不敏感、放療后復(fù)發(fā)以及中晚期的患者,可采取化學(xué)藥物治療。但傳統(tǒng)的放、化療存在特異性抗腫瘤能力低、殺傷指數(shù)過(guò)小、副作用大等缺點(diǎn)。
　　 分子靶向治療作為腫瘤學(xué)研究的一個(gè)新興的熱點(diǎn)對(duì)于改善臨床鼻咽癌的療效具有重要意

2、義。它針對(duì)可能導(dǎo)致細(xì)胞癌變的環(huán)節(jié),如細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路、原癌基因和抑癌基因、細(xì)胞因子及受體、抗腫瘤血管形成、自殺基因等,從分子水平來(lái)逆轉(zhuǎn)這種惡性生物學(xué)行為,從而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng),甚至使其完全消退的一種全新的生物治療模式。雷帕霉素作為一種新型的分子靶向治療藥物,在諸多實(shí)體瘤中取得了不同程度的療效,其中部分研究已經(jīng)進(jìn)入了Ⅲ期臨床試驗(yàn),成果令人鼓舞,同時(shí)讓我們對(duì)雷帕霉素治療鼻咽癌的效果充滿了期待。如果雷帕霉素能夠成功用于鼻咽癌的分子靶向治療,不

3、僅能造?；颊?提高生存率,還能產(chǎn)生相當(dāng)?shù)慕?jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
　　 本研究以雷帕霉素為切入點(diǎn),探討該藥物對(duì)不同生物學(xué)特性的鼻咽癌細(xì)胞所產(chǎn)生的生長(zhǎng)抑制作用及其蛋白質(zhì)分子機(jī)制。并以此為基礎(chǔ),進(jìn)一步揭示沉默鼻咽癌中HSP70表達(dá)對(duì)雷帕霉素抑制作用的影響以及相關(guān)依據(jù)初探。整個(gè)研究?jī)?nèi)容分三部分進(jìn)行:
　　 第一部分雷帕霉素靶向阻斷mTOR信號(hào)通路對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響
　　 方法：
　　 通過(guò)MTS法確定roTO

4、R抑制劑雷帕霉素作用三株鼻咽癌細(xì)胞產(chǎn)生最佳生長(zhǎng)抑制率所需濃度和作用時(shí)間。
　　 結(jié)果：
　　 1.雷帕霉素對(duì)不同生物學(xué)特性的鼻咽癌細(xì)胞均有抑制其生長(zhǎng)的作用,該作用的發(fā)揮可能是通過(guò)靶向抑制mTOR激酶活性來(lái)實(shí)現(xiàn)的;
　　 2.抑制率呈現(xiàn)劑量和時(shí)間依賴(lài)性,不同細(xì)胞株之間無(wú)顯著差別,基本穩(wěn)定在400％～50％之間,最高為53.9％;
　　 3.對(duì)于三個(gè)細(xì)胞株而言,100nM雷帕霉素作用48小時(shí)均能讓藥物所致生長(zhǎng)

5、抑制率進(jìn)入平臺(tái)期。
　　 第二部分雷帕霉素靶向抑制人鼻咽癌細(xì)胞生長(zhǎng)蛋白質(zhì)分子機(jī)制
　　 方法：
　　 1.采用Western Blotting法檢測(cè)不同濃度雷帕霉素作用下三株細(xì)胞內(nèi)P13K/Akt/mTOR信號(hào)通路中關(guān)鍵性蛋白標(biāo)記物(p-Akt Ser473、Akt、p-mTOR Ser2448、mTOR)表達(dá)情況;
　　 2.采用Western Blotting法檢測(cè)100nM雷帕霉素作用不同時(shí)間后三株

6、細(xì)胞內(nèi)P13K/Akt/mTOR信號(hào)通路中關(guān)鍵性蛋白標(biāo)記物(p-AktSer473、Akt、p-mTOR Ser2448、mTOR)表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.CNE-1和6-10B細(xì)胞p-mTOR Ser2448表達(dá)情況表現(xiàn)出一定的濃度、時(shí)間依賴(lài)性,而5-8F細(xì)胞中該指標(biāo)不隨藥物濃度和作用時(shí)間改變而變化;
　　 2.6-10B和5-8F細(xì)胞p-Akt Ser473隨藥物濃度增加而表達(dá)增高,而CNE-1則

7、呈“上升-下降”趨勢(shì);
　　 3.三個(gè)細(xì)胞株p-Akt Ser473當(dāng)100nM雷帕霉素作用不同時(shí)間后,在1hr時(shí)表達(dá)明顯增高,隨著藥物作用時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng),表達(dá)較1hr相比有下降,但是除6-10B外,均比0hr高;
　　 4.mTOR、Akt、HSP70的表達(dá)保持相對(duì)穩(wěn)定,未呈現(xiàn)明顯時(shí)間、劑量依賴(lài)性改變。
　　 第三部分沉默HSP70調(diào)控雷帕霉素對(duì)鼻咽癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用蛋白質(zhì)分子機(jī)制研究
　　 方法：

8、>　　 1.分別采用RT-PCR法和Western Blotting法初步驗(yàn)證HSP70siRNA在鼻咽癌細(xì)胞株中使目標(biāo)基因/蛋白產(chǎn)生滿意沉默效果所需作用時(shí)間;
　　 2.采用MTS法進(jìn)行Control siRNA組、HSP70 siRNA組、ControlsiRNA+100nM Rapa組和HSP70 siRNA+100nM Rapa組組間生長(zhǎng)抑制率比較;
　　 3.采用光學(xué)顯微鏡明視野觀察不同干預(yù)措施下的四組細(xì)胞形

9、態(tài)學(xué)變化;
　　 4.采用Western Blotting法檢測(cè)Control siRNA組、HSP70 siRNA組、Control siRNA+100nM Rapa組和HSP70 siRNA+100nM Rapa組細(xì)胞中P13K/Akt/mTOR信號(hào)通路中關(guān)鍵性蛋白標(biāo)記物(p-AktSer473、Akt、p-mTOR Ser2448、mTOR)表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.RT-PCR法顯示siRNA作

10、用48hrs,在基因水平可達(dá)到HSP70相對(duì)較高抑制率,而Western Blotting法顯示siRNA作用72hrs,可在蛋白質(zhì)水平達(dá)到HSP70相對(duì)較高抑制率;
　　 2.三個(gè)細(xì)胞株中四個(gè)不同干預(yù)組互相比較,HSP70 siRNA+100nM Rapa組生長(zhǎng)抑制率最高;
　　 3.與Control siRNA組比較,Control siRNA+100nM Rapa組與第二部分的Rapa作用48hrs的情況相類(lèi)似,能

11、夠提升細(xì)胞中p-AktSer473表達(dá),而HSP70 siRNA+100nM Rapa組中,p-Akt Ser473表達(dá)下降;
　　 4.與單用siRNA組別比較,Comrol siRNA+100nM Rapa和HSP70 siRNA+100nM Rapa組中,CNE-1和6-10B細(xì)胞p-mTORSer2448表達(dá)下調(diào),而5-8F無(wú)明顯變化;
　　 5.mTOR、Akt的表達(dá)組間比較無(wú)明顯變化。
　　 結(jié)論：<

12、br>　　 本文采用MTS法、Western Blotting法、脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)并輔以逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)等實(shí)驗(yàn)方法研究雷帕霉素對(duì)不同生物學(xué)特性的人鼻咽癌細(xì)胞株生長(zhǎng)抑制作用,并通過(guò)檢測(cè)P13K/Akt/mTOR.信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白標(biāo)記物揭示細(xì)胞生長(zhǎng)抑制現(xiàn)象產(chǎn)生的相關(guān)機(jī)制,接著觀察雷帕霉素對(duì)HSP70表達(dá)下調(diào)的鼻咽癌細(xì)胞所產(chǎn)生的影響,最后初步探討HSP70 siRNA與雷帕霉素聯(lián)合抑制鼻咽癌細(xì)胞生長(zhǎng)所涉及的相關(guān)機(jī)制,得出如下結(jié)論:<

13、br>　　 1.雷帕霉素在體外能夠一定程度抑制鼻咽癌細(xì)胞株的生長(zhǎng),不同細(xì)胞株之間抑制率無(wú)明顯差異;
　　 2.雷帕霉素抑制p-mTOR Ser2448表達(dá)和mTOR的激酶活性是導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)抑制產(chǎn)生的原因;
　　 3.雷帕霉素誘導(dǎo)p-Akt Ser473表達(dá)上調(diào)是導(dǎo)致藥物對(duì)鼻咽癌細(xì)胞株生長(zhǎng)抑制率不高的原因之一;
　　 4.雷帕霉素能夠引起部分細(xì)胞株p-mTOR Ser2448表達(dá)下調(diào),但是這并非反映生長(zhǎng)抑制率情況