雷帕霉素脂質體滴眼液對大鼠角膜新生血管抑制作用的實驗研究.pdf

1、目的：制備雷帕霉素(RAPA)脂質體滴眼液，建立大鼠角膜堿燒傷動物模型，研究RAPA對大鼠角膜新生血管(corneal neovasc[1larization，CNV)的抑制作用及它對HIF-lQ及VEGF表達的影響，探討RAPA抑制角膜新生血管的機理，并為通過抑制HIF-1Q阻斷VEGF信號傳導通路抑制角膜新生血管提供理論依據(jù)。 方法：利用薄膜分散法制備RAPA脂質體滴眼液，以正交設計法研究制備工藝中影響脂質體制備質量的主要影

2、響因素，篩選出較理想的處方。將42只健康Wistar大鼠隨機分為四組：A組正常對照組6只。B組堿燒傷空白對照組12只。C組堿燒傷空白脂質體對照組12只。D組堿燒傷RAPA脂質體治療組12只。制備大鼠角膜堿燒傷動物模型，堿燒傷后： D組RAPA脂質體滴眼液滴眼，每天三次。C組空白脂質體滴眼液滴眼，每天三次。B組不予處理。另外各組氯霉素滴眼液預防感染，每天四次：每日裂隙燈觀察眼局部情況，并詳細記錄堿燒傷后大鼠角膜反應情況及新生血管生長情況，

3、并于堿燒傷后4d、7d、14d分別測量B、C、D三組角膜新生血管生長長度，計算生長面積。分別于堿燒傷后1d、4d、7d、14d隨機抽取各組大鼠取材。免疫組織化學方法檢測HIF-1Q及VEGF蛋白的表達，計算機圖象分析，測定陽性細胞的光密度值：半定量逆轉錄聚合酶鏈反應(semi-qLlantitative reveFse。transcription p01ymerase chain reaction，RT-PCR)方法檢測角膜組織HIF_

4、lQmRNA及VEGF Mrna的表達，數(shù)字凝膠圖象分析系統(tǒng)測定各條帶光密度值(Q及VEGF分別與GAPDH的[DV比值作為HIF-Lq及VEGF表達水平的參數(shù)。 結果： 1．制得的RAPA脂質體，為完整的類球形，平均粒徑為145.2nm，包封率為90.02％，RAPA脂質體滴眼液中RAPA含量高，粒徑合適，可作為滴眼液用于動物實驗。 2．堿燒傷后ld時僅見損傷區(qū)角膜上皮水腫，角鞏膜緣周圍充血水腫；堿燒傷后4d可

5、見角鞏膜緣處有角膜新生血管芽呈毛刷狀向角膜中央生長。第7d時，CNV顯著變長，面積增加。14d時新生血管交織呈網(wǎng)狀，基本布滿整個角膜。 3．RAPA治療組與空白對照組及空白脂質體對照組相比CNV生長遲緩，稀疏，退化較早。CNV面積比較差異有顯著性(PO.05)。 4．正常大鼠角膜上皮細胞有微弱的HIF-1 Q蛋白、VEGF蛋白的表達：堿燒傷后角膜上皮細胞、內皮細胞、

6、炎癥細胞，新形成的血管內皮細胞，F(xiàn).1Q蛋白及VEGF蛋白表達均明顯增強，4d時表達最強，7d時開始下降，14d已降至正常。RAPA治療組HIF-1Q、VEGF的表達被顯著抑制，與空白對照組及空白脂質體對照組相比差異有顯著性(P<0.01)。 5．正常大鼠角膜有少量VEGFmRNA的表達，堿燒傷后表達增強，4d時表達最強，7d時開始下降，14d已降至正常。HIF-1 Q Mrna在正常角膜基本不表達，堿燒傷后有所增強，1d及4d

7、時表達均高于正常，7d時已降至正常。RAPA治療組HIF-1 Q Mrna、VEGFmRNAF的表達被顯著抑制，與空白對照組及空白脂質體對照組相比差異有顯著性(P