雷帕霉素脂質(zhì)體滴眼液對大鼠真菌性角膜炎治療作用的實驗研究.pdf

1、目的：制備雷帕霉素（rapamycin，RAPA，商品名Sirolimus）脂質(zhì)體滴眼液，研究RAPA對大鼠真菌性角膜炎(fungal keratitis，F(xiàn)K)的治療作用及它對單核細(xì)胞趨化蛋白-1(chemotactic protein-1，MCP-1)，白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)表達(dá)的影響，探討RAPA治療FK的機(jī)理，為臨床真菌性角膜炎藥物治療提供思路及實驗依據(jù)。
　　方法：利用薄膜分散法制備

2、RAPA脂質(zhì)體滴眼液，以正交設(shè)計法研究制備工藝中影響脂質(zhì)體制備質(zhì)量的主要影響因素，篩選出較理想的處方。將96只健康Wistar大鼠隨機(jī)分為四組：A組正常對照組6只。B組真菌性角膜炎空白對照組30只。C組真菌性角膜炎空白脂質(zhì)體對照組30只。D組真菌性角膜炎RAPA脂質(zhì)體治療組30只。A組大鼠不予處理；B、C、D組大鼠先制備FK動物模型，建模成功后：D組RAPA脂質(zhì)體滴眼液滴眼，每天四次，C組空白脂質(zhì)體滴眼液滴眼，每天四次，B組不予特殊處理

3、。每日裂隙燈顯微鏡觀察眼局部情況，并分別于建模后的1d、3d、5d、7d、14d詳細(xì)記錄真菌感染后大鼠角膜反應(yīng)情況，評分并拍照；同時每個時間點隨機(jī)抽取各組6只大鼠取材，HE染色及PAS染色行組織病理學(xué)檢查；免疫組織化學(xué)方法檢測MCP-1、IL-1β蛋白的表達(dá)，計算機(jī)圖象分析，測定陽性細(xì)胞的光密度值;半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(semi-quantitative reverse transcription polymerase chain

4、reaction，RT-PCR)方法檢測角膜組織MCP-1、IL-1βmRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果：1.制得的RAPA脂質(zhì)體，為完整的類球形，平均粒徑為145.2nm，包封率為90.02％，RAPA脂質(zhì)體滴眼液中RAPA含量高，粒徑合適，可作為滴眼液用于動物實驗。2.裂隙燈顯微鏡檢查可見：FK感染后1天，出現(xiàn)角膜水腫渾濁，3天，渾濁加重，蔓延至整個角膜，中央見潰瘍灶，5天，潰瘍加重，部分穿孔，7天，新生血管形成，開始瘢痕愈合。其中，

5、RAPA治療組角膜病變程度減輕，臨床評分低于空白對照組及空白脂質(zhì)體對照組。3.HE染色及PAS染色，HE染色顯示：第1天角膜明顯水腫，少量炎癥細(xì)胞侵潤，第3天，感染部位角膜結(jié)構(gòu)完全被破壞，出現(xiàn)潰瘍灶，大量的炎癥細(xì)胞侵潤；第5天，角膜組織變薄，基質(zhì)纖維疏松，炎癥細(xì)胞減少；第7天，纖維細(xì)胞增多，出現(xiàn)機(jī)化，少量炎癥細(xì)胞侵潤。PAS染色結(jié)果顯示：感染后第1天，病灶可見少量菌絲；第3天，見大量的菌絲，第5天，病灶內(nèi)可見少數(shù)幾根菌絲或未找見菌絲；第

6、7天則基本未查見菌絲。RAPA治療組較空白對照組及空白脂質(zhì)體對照組角膜病變程度輕，真菌數(shù)量減少。4.正常大鼠角膜上皮細(xì)胞有微弱的MCP-1、IL-1β蛋白的表達(dá);FK感染后，MCP-1、IL-1β蛋白1d開始表達(dá)增強，3d時達(dá)高峰，5d開始下降，隨后逐漸降低，14d略高于正常。RAPA治療組MCP-1、IL-1β蛋白的表達(dá)被顯著抑制，與FK對照組及FK空白脂質(zhì)體對照組相比差異有顯著性（P<0.01）。5.正常大鼠角膜上皮細(xì)胞有微弱的MC

7、P-1、IL-1βmRNA的表達(dá);FK感染后，MCP-1、IL-1βmRNA1d開始表達(dá)增強，3d時達(dá)高峰，5d開始下降，隨后逐漸降低，14d略高于正常。RAPA治療組MCP-1、IL-1βmRNA的表達(dá)被顯著抑制，與FK對照組及FK空白脂質(zhì)體對照組相比差異有顯著性（P<0.01）。
　　結(jié)論：1.脂質(zhì)體是RAPA良好的藥物載體。
　　2.FK后角膜病變逐漸進(jìn)展，5天達(dá)高峰，隨后逐漸開始減輕，真菌負(fù)荷3天最重，隨后逐漸減少。

8、
　　3.正常角膜組織有少量MCP-1、IL-1β蛋白及mRNA的表達(dá)，F(xiàn)K后它們的表達(dá)增強，3d時達(dá)高峰，5d開始下降，隨后逐漸降低，14d略高于正常。
　　4.RAPA對真菌性角膜炎有較好的治療作用。
　　5.RAPA能減少真菌性角膜炎的真菌負(fù)荷。
　　6.RAPA能顯著抑制MCP-1、IL-1β蛋白、MCP-1、IL-1βmRNA的表達(dá)。
　　7.RAPA可能是通過直接抑制真菌及抗炎、免疫調(diào)節(jié)作用來發(fā)