Ac-SDKP調(diào)節(jié)α-Ac-Tub對矽肺纖維化的抑制作用及其機制.pdf

1、第一部分α-Ac-Tub在人體（煤）矽肺標本中的表達及其病理學(xué)意義
　　目的：觀察與分析α-Ac-Tub在人體（煤）矽肺標本中表達及其臨床病理學(xué)的意義。
　　方法：
　　1（煤）矽肺患者樣本來自于59例尸檢病例，年齡最小30歲，最大77歲，平均年齡52歲。分別來自內(nèi)蒙、山西、湖南、河北等省煤礦以及水泥、陶瓷、耐火材料廠的工人（煤礦井下作業(yè)工人45例、其他作業(yè)工人14例）。其中Ⅰ期（煤）矽肺22例、Ⅱ期（煤）矽肺8例、Ⅲ

2、期（煤）矽肺7例，（煤）矽塵性反應(yīng)22例。最短接塵史7年，最長為46年，平均22年。13例對照組選取外科手術(shù)切除肺組織標本（均為年齡相近無接塵史的臨床患者）。
　　2 HE染色、Masson染色觀察病理形態(tài)變化。免疫組織化學(xué)染色法用以檢測肺組織中α-SMA、vimentin和α-Ac-Tub的表達情況。免疫熒光法檢測α-Ac-Tub和vimentin以及α-Ac-Tub和SP-A的共定位表達情況。
　　結(jié)果：
　　1在

3、人體（煤）矽肺標本中，能夠較好的觀察到矽肺病變發(fā)生演變的過程。既吞噬粉塵的巨噬細胞性肺泡炎---細胞性結(jié)節(jié)---細胞纖維性結(jié)節(jié)---纖維性結(jié)節(jié)（包括玻璃樣變性的結(jié)節(jié)）。
　　2α-SMA陽性標記的肌成纖維細胞定位分布于結(jié)節(jié)性病灶和彌漫性間質(zhì)纖維化區(qū)域。
　　3α-Ac-Tub可表達于正常肺組織的多種細胞（包括支氣管上皮細胞、血管內(nèi)皮細胞、肺泡上皮細胞和肺成纖維細胞等）。在人體（煤）矽肺標本中于病變區(qū)（結(jié)節(jié)性病灶和彌漫性間質(zhì)纖

4、維化區(qū)域）缺失表達。
　　4免疫熒光結(jié)果顯示在人體矽肺標本中有α-Ac-Tub和 vimentin、α-Ac-Tub和SP-A陽性共定位表達的細胞，其中vimentin在病變纖維化區(qū)域的表達明顯增強，而α-Ac-Tub和 SP-A在病變的結(jié)節(jié)病灶和間質(zhì)纖維化區(qū)域缺失表達。
　　第二部分 Ac-SDKP靶向調(diào)節(jié)α-Ac-Tub的表達對抑制大鼠矽肺纖維化的調(diào)控作用
　　目的：采用支氣管灌注SiO2構(gòu)建矽肺大鼠模型，并予以A

5、c-SDKP抗纖維化治療和預(yù)防治療。通過對α-Ac-Tub、HDAC6和α-SMA在矽肺大鼠肺組織中的定位、分布與表達的觀察與分析，研究與探討α-Ac-Tub在矽肺發(fā)生過程中的作用，以及Ac-SDKP對α-Ac-Tub調(diào)節(jié)在抑制矽肺纖維化形成時的作用與機制。
　　方法：
　　1采用非暴露式一次性灌注SiO2構(gòu)建矽肺大鼠模型。實驗分組為：1）對照4 w組：在腹腔內(nèi)埋入注有2 ml生理鹽水的微量緩釋膠囊，支氣管內(nèi)灌注1 ml生理

6、鹽水，飼養(yǎng)4 w后處理動物；2）對照8 w組：腹腔內(nèi)埋入注有2 ml生理鹽水的微量緩釋膠囊，支氣管內(nèi)灌注1 ml生理鹽水，飼養(yǎng)8 w后處理動物；3）矽肺模型4 w組：在腹腔內(nèi)埋入注有2 ml生理鹽水的微量緩釋膠囊，支氣管內(nèi)灌注含有50 mg SiO2的1 ml生理鹽水，飼養(yǎng)4 w后處理動物；4）矽肺模型8 w組：在腹腔內(nèi)埋入注有2 ml生理鹽水的微量緩釋膠囊，支氣管內(nèi)灌注含有50 mg SiO2的1 ml生理鹽水，飼養(yǎng)8 w后處理動物；

7、5）Ac-SDKP抗纖維化治療組：支氣管內(nèi)灌注含有50 mg SiO2的1 ml生理鹽水，在腹腔內(nèi)埋入注有2 ml生理鹽水的微量緩釋膠囊，4 w后更換為含有800μg/kg/d Ac-SDKP的2 ml生理鹽水的微量緩釋膠囊，持續(xù)至8 w后處理；6）Ac-SDKP預(yù)防治療組：灌塵前48 h腹腔內(nèi)埋入含有800μg/kg/d Ac-SDKP的2 ml生理鹽水的微量緩釋膠囊，支氣管內(nèi)灌注含有50 mg SiO2的1 ml生理鹽水，持續(xù)至8

8、w后處理。
　　2 HE染色觀察肺組織病理形態(tài)；免疫組織化學(xué)染色檢測α-Ac-Tub、α-SMA、HDAC6在肺組織中的定位、分布與表達。免疫熒光法檢測α-Ac-Tub和α-Tub、α-Ac-Tub和 SP-A、α-Ac-Tub和 vimentin、HDAC6和α-Ac-Tub、HDAC6和α-SMA的共表達。免疫印跡法（Western blot）檢測α-SMA、α-Ac-Tub、HDAC6和I型膠原的表達水平。
　　結(jié)果：

9、
　　1HE染色結(jié)果顯示，對照4w組和8w組大鼠雙側(cè)肺組織結(jié)構(gòu)清晰，未見明顯異常。矽肺模型4w組可見肺泡壁增寬，多伴有巨噬細胞和炎細胞的浸潤，可見細胞性矽結(jié)節(jié)的形成；矽肺模型8w組多見矽結(jié)節(jié)的融合，伴有間質(zhì)肺纖維化的形成。無論是Ac-SDKP抗纖維化治療組還是預(yù)防治療組，其矽結(jié)節(jié)的面積較矽肺模型8w組顯著減小，肺組織內(nèi)纖維化程度明顯降低。
　　2免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，α-Ac-Tub除可強表達于支氣管上皮細胞外，還可在肺

10、泡壁上的肺泡Ⅱ型上皮細胞、成纖維細胞和內(nèi)皮細胞中陽性表達，使用不同公司商品化抗體均獲得一致的結(jié)果。免疫熒光結(jié)果顯示α-Ac-Tub存在和SP-A以及vimentin陽性共表達細胞。
　　3免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，在對照組中，α-SMA僅陽性表達于氣管、血管的平滑肌細胞，而在矽肺模型組中，α-SMA可強表達于矽結(jié)節(jié)和間質(zhì)纖維化區(qū)。而α-Ac-Tub除可陽性表達于支氣管纖毛上皮細胞，而在肺泡壁上多種細胞中陽性表達；在矽肺模型組中，α

11、-Ac-Tub在矽結(jié)節(jié)和間質(zhì)纖維化區(qū)域中缺失表達，尚在矽結(jié)節(jié)周圍較為正常肺泡壁中仍存在明顯的陽性表達。免疫印跡（western blot）結(jié)果顯示，與對照組相比，矽肺模型組的I型膠原、α-SMA表達水平上調(diào)，而α-Ac-Tub的表達下調(diào)；給予 Ac-SDKP抗纖維化治療組或預(yù)防治療后，能夠顯著上調(diào)α-Ac-Tub的表達，同時下調(diào)I型膠原和α-SMA蛋白水平。
　　4免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，HDAC6在正常對照組中可陽性表達于支氣

12、管上皮細胞（胞漿表達）和部分肺泡Ⅱ型上皮細胞（核表達）中，而在模型組中多表達于巨噬細胞和間質(zhì)纖維化區(qū)域（胞漿表達）。免疫熒光檢測結(jié)果顯示，HDAC6與α-SMA多高表達于矽結(jié)節(jié)區(qū)域，而α-Ac-Tub陽性表達多位于矽結(jié)節(jié)邊緣以及較為正常的肺泡壁上。免疫印跡（western blot）結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組 HDAC6的表達顯著上調(diào)，而給予Ac-SDKP抗纖維化治療和預(yù)防治療均能夠顯著抑制HDAC6的表達。
　　第三部分 A

13、c-SDKP對α-Ac-Tub的調(diào)節(jié)抑制AngⅡ介導(dǎo)的肌成纖維細胞分化的作用及其機制
　　目的：原代培養(yǎng)的大鼠肺成纖維細胞，并予以AngⅡ誘導(dǎo)分化為肌成纖維細胞。給予Ac-SDKP、AT1抑制劑valsartan、HDAC6特異性抑制劑TCS HDAC620b和ROCK信號抑制劑Y-27632預(yù)處理，觀察Ac-SDKP是否可通過對AT1、ROCK信號通路的調(diào)節(jié)而抑制HDAC6的表達，進而穩(wěn)定α-Ac-Tub，發(fā)揮其抑制肌成纖維細胞

14、分化的作用。
　　方法：將原代培養(yǎng)大鼠肺成纖維細胞分組為：1）對照組；2）AngⅡ誘導(dǎo)組；3）AngⅡ+Ac-SDKP組；4）AngⅡ+valsartan組；5）AngⅡ+TCS HDAC620b組；6）AngⅡ+Y-27632組。
　　結(jié)果：
　　1免疫熒光結(jié)果顯示，AngⅡ誘導(dǎo)后，α-Tub熒光強度并無明顯變化，而α-Ac-Tub熒光強度顯著降低。
　　2免疫熒光結(jié)果顯示，與對照組相比，AngⅡ能夠顯著誘導(dǎo)肺

15、成纖維細胞向肌成纖維細胞分化，胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量交叉和平行排列的肌絲樣α-SMA蛋白在胞漿內(nèi)呈現(xiàn)少量綠色的微弱熒光表達，α-Ac-Tub蛋白在胞漿以細胞核為中心呈現(xiàn)出放射狀細絲樣紅色熒光表達；AngⅡ顯著促進α-SMA的表達，胞漿內(nèi)α-SMA呈現(xiàn)為或交叉或平行的肌絲樣結(jié)構(gòu)，而標記α-Ac-Tub的熒光明顯減弱。予以Ac-SDKP、valsartan、TCS HDAC620b以及Y-27632預(yù)處理，較于AngⅡ誘導(dǎo)組比較，能夠顯著減弱α-S

16、MA的熒光強度，而增加α-Ac-Tub熒光表達。免疫印跡（western blot）結(jié)果顯示：與對照組相比，AngⅡ組的Ⅰ型膠原和α-SMA表達水平顯著上調(diào)，而α-Ac-Tub的表達下調(diào)；予以Ac-SDKP、valsartan、TCS HDAC620b以及Y-27632預(yù)處理能夠顯著抑制AngⅡ誘導(dǎo)的相應(yīng)蛋白變化。
　　3免疫印跡法結(jié)果顯示，與對照組相比，AngⅡ能夠顯著上調(diào)HDAC6的蛋白表達水平，而予以 Ac-SDKP、val