骨化三醇對UUO模型大鼠腎間質(zhì)纖維化抑制作用及其對內(nèi)皮細(xì)胞參與纖維化調(diào)控作用的研究.pdf

1、目的:通過觀察骨化三醇對UUO大鼠腎間質(zhì)纖維化抑制作用和內(nèi)皮細(xì)胞TGF-β1、ICAM-1、HIF-1α、VEGF、VEGFR-2基因和蛋白水平表達(dá)的影響，從內(nèi)皮細(xì)胞角度探討骨化三醇對腎間質(zhì)纖維化的抑制作用機制。
　　 方法:
　　 1、通過體內(nèi)試驗觀察骨化三醇對UUO大鼠腎間質(zhì)纖維化抑制作用。
　　 1.1、用180只清潔6周齡雄性SD大鼠，建立UUO模型。將動物分為五組（每組36只）:
　　 ①UUO

2、空白對照組;
　　 ②手術(shù)對照組;
　　 ③UUO+骨化三醇高劑量組;
　　 ④UUO+骨化三醇低劑量組;
　　 ⑤UUO+貝那普利組。
　　 手術(shù)當(dāng)天給藥，每天給藥1次，UUO+骨化三醇高、低劑量組分別給予骨化三醇6ng/100g、3ng/100g溶于1mL橄欖油灌胃，UUO+貝那普利組將鹽酸貝那普利片0.17mg/100g溶于1mL生理鹽水灌胃;UUO對照組將左側(cè)輸尿管結(jié)扎后縫合;手術(shù)對照組和

3、UUO組每天僅用1mL生理鹽水灌胃;并于第1、3、5、7、10、14天每組處死6只大鼠，留取標(biāo)本。
　　 1.2、取梗阻側(cè)腎臟采用HE染色法觀察10，14天組腎組織病理變化，天狼腥紅染色法觀察14天組腎纖維化病理改變。
　　 1.3、ELISA法檢測7，10，14天組大鼠血清TNF噸表達(dá)水平。
　　 1.4、采用RT-PCR和western blot法觀察7，10，14天組轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β1)、細(xì)胞間粘附

4、分子-1（ICAM-1）mRNA和蛋白的表達(dá)。
　　 1.5、采用Western Blot法觀察1，3，5天組血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體2(VEGFR-2)、缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)蛋白的表達(dá)。
　　 2、通過細(xì)胞學(xué)試驗探討骨化三醇對內(nèi)皮細(xì)胞參與纖維化病理變化的影響。
　　 2.1、內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng):
　　 人內(nèi)皮細(xì)胞株(Eahy926)，用含10％胎牛血清的高糖D

5、MEM培養(yǎng)基在37℃、5％ CO2、飽和濕度下培養(yǎng)，至Eahy926細(xì)胞生長成單層后備用。將Eahy926細(xì)胞分為5組:
　　 ①氯化鈷刺激組;
　　 ②空白對照組;
　　 ③氯化鈷+骨化三醇高劑量組（終濃度為10-8 mol/L）;
　　 ④氯化鈷+骨化三醇中劑量組（終濃度為10-9 mol/L）;
　　 ⑤氯化鈷+骨化三醇低劑量組（終濃度為10-10mol/L）。
　　 2.2、采用M

6、TT法測定骨化三醇對氯化鈷刺激的Eahy926細(xì)胞增殖作用的影響。
　　 2.3、采用ELISA法檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF表達(dá)水平。
　　 2.4、用RT-PCR、Western Blot法測定骨化三醇對Eahy926細(xì)胞的影響。RT-PCR法測定VEGF,VEGFR-2，HIF-1α和ICAM-1 mRNA表達(dá)水平，Western Blot法測定VEGFR-2，HIF-1α，ICAM-1蛋白的相對含量。

7、　　 2.5、采用流式細(xì)胞術(shù)檢測各實驗組內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率。
　　 3、數(shù)據(jù)資料用((x)±SD)表示。
　　 結(jié)果:
　　 1、骨化三醇對腎纖維化模型大鼠腎臟病理的改變的影響
　　 UUO術(shù)后，各時間點大鼠表現(xiàn)不同程度的梗阻側(cè)腎臟腫大，腎皮質(zhì)變薄，腎盂腎盞增大。手術(shù)對照組大鼠腎臟無明顯改變，HE染色觀察各UUO組顯示腎小管間質(zhì)中炎癥細(xì)胞增多，腎小管細(xì)胞不同程度的變性、萎縮及壞死，骨化三醇高、低劑量組和貝那

8、普利陽性對照組腎臟病變程度輕于同一時間點UUO組。天狼腥紅染色觀察UUO組大鼠腎間質(zhì)膠原產(chǎn)生增多，各藥物治療組大鼠腎間質(zhì)膠原減少，手術(shù)對照組大鼠腎間質(zhì)膠原無明顯增加。
　　 2、骨化三醇對UUO術(shù)后7，10，14天組大鼠血清TNF-α水平的影響
　　 各藥物治療組和UUO組TNF-α濃度較手術(shù)對照組升高(P＜0.05）。隨著梗阻時間的延長，TNF-α的表達(dá)有上升的趨勢，高低劑量骨化三醇和貝那普利可以降低UUO大鼠血清TN

9、F-α的濃度（P＜0.05)。
　　 3、骨化三醇對UUO術(shù)后7，10，14天組大鼠腎組織TGF-β1，ICAM-1 mRNA和蛋白水平的影響
　　 各藥物治療組和UUO組TGF-β1，ICAM-1 mRNA和蛋白表達(dá)較手術(shù)對照組升高（P＜0.05），且隨著梗阻時間的延長表達(dá)量上升，骨化三醇高低劑量和貝那普利可以明顯降低同時間點UUO大鼠TGF-β1，ICAM-1蛋白和mRNA的表達(dá)(P＜0.05）。
　　 4、

10、骨化三醇對UUO術(shù)后1，3，5天組大鼠腎組織HIF-1α，VEGF，VEGFR-2蛋白水平的影響
　　 4.1、骨化三醇對UUO術(shù)后1，3，5天組大鼠腎組織HIF-1α蛋白水平的影響
　　 各藥物治療組和UUO組HIF-1α蛋白表達(dá)較手術(shù)對照組升高（P＜0.05），且隨著梗阻時間的延長保持相對穩(wěn)定，骨化三醇高低劑量和貝那普利可以明顯降低UUO大鼠HIF-1α蛋白的表達(dá)（P＜0.05）。
　　 4.2、骨化三醇對U

11、UO術(shù)后1，3，5天組大鼠腎組織VEGF蛋白水平的影響
　　 骨化三醇高低劑量和貝那普利可以明顯升高同時間點UUO大鼠VEGF蛋白的表達(dá)(P＜0.05)，但隨著梗阻時間的延長表達(dá)有下降趨勢。
　　 4.3、骨化三醇對UUO術(shù)后1，3，5天組大鼠腎組織VEGFR-2蛋白水平的影響
　　 各UUO組VEGFR-2蛋白表達(dá)較手術(shù)對照組升高不明顯（P＞0.05）。骨化三醇高低劑量和貝那普利可以明顯升高同時間點UUO大鼠V

12、EGFR-2蛋白的表達(dá)（P＜0.05）。但隨著梗阻時間的延長表達(dá)有下降趨勢。
　　 5、不同濃度骨化三醇對氯化鈷誘導(dǎo)的Eahy926細(xì)胞增殖的影響
　　 當(dāng)骨化三醇終濃度升至10-9 mol/L，細(xì)胞生長增殖最明顯，與氯化鈷刺激組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）。
　　 6、骨化三醇對氯化鈷誘導(dǎo)的Eahy926細(xì)胞上清中VEGF的表達(dá)的影響
　　 各藥物治療組和氯化鈷刺激組VEGF濃度較空白對照組升

13、高（P＜0.05），骨化三醇各劑量組與氯化鈷刺激組相比VEGF均升高(P＜0.05)，且當(dāng)骨化三醇終濃度為10-9 mol/L時VEGF表達(dá)最明顯。
　　 7、骨化三醇對氯化鈷誘導(dǎo)的Eahy926細(xì)胞VEGF，HF-1α，VEGFR-2，ICAM-1，mRNA水平的影響
　　 氯化鈷刺激組HIF-1α，ICAM-1 mRNA的表達(dá)較空白對照組升高(P＜0.05）。骨化三醇作用24h之后，Eahy926細(xì)胞中HIF-1α，

14、ICAM-1的表達(dá)受到抑制，與氯化鈷刺激組相比(P＜0.05））。而VEGF，VEGFR-2的表達(dá)較氯化鈷刺激組升高（P＜0.05）。
　　 8、骨化三醇對氯化鈷誘導(dǎo)的Eay926細(xì)胞產(chǎn)生VEGFR-2，HIF-1α，ICAM-1蛋白水平的影響
　　 氯化鈷刺激組HIF-1α、ICAM-1蛋白表達(dá)與空白組相比明顯升高(P＜0.05），VEGFR-2與空白對照組相比升高不明顯（P＞0.05）。經(jīng)過骨化三醇作用24h之后，各

15、組HIF-1α、ICAM-1蛋白表達(dá)受到抑制，與氯化鈷刺激組相比(P＜0.05）;而VEGFR-2蛋白的表達(dá)較氯化鈷刺激組相比顯著升高(P＜0.05）。
　　 9、不同劑量骨化三醇對經(jīng)氯化鈷誘導(dǎo)的Eahy926細(xì)胞凋亡的影響
　　 經(jīng)氯化鈷刺激24h后，氯化鈷刺激組細(xì)胞凋亡率明顯升高與空白對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）。經(jīng)過不同劑量骨化三醇作用24h之后，Eahy926細(xì)胞凋亡率明顯下降，與氯化鈷刺激組相

16、比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）。
　　 結(jié)論:
　　 1、骨化三醇具有抑制UUO大鼠腎間質(zhì)纖維化的作用。
　　 2、骨化三醇對UUO大鼠腎間質(zhì)纖維化的抑制作用可能與其上調(diào)UUO大鼠腎組織中 VEGF，VEGFR-2蛋白的表達(dá)，降低HIF-1α，ICAM-1，TGF-β1的表達(dá)有關(guān)，通過影響上述纖維化相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，減輕腎小管周圍毛細(xì)血管的破壞，減少腎小管上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化和成纖維細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)，從而減

17、輕腎間質(zhì)纖維化。
　　 3、骨化三醇使氯化鈷處理的Eahy926細(xì)胞VEGF，VEGFR-2表達(dá)升高，HIF-1α，ICAM-1表達(dá)下降（與骨化三醇對UUO大鼠纖維化腎組織中上述分子表達(dá)的影響一致），并顯示能夠降低內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率。提示骨化三醇可能通過影響內(nèi)皮細(xì)胞纖維化相關(guān)細(xì)胞因子、受體及粘附分子表達(dá)，抑制局部炎癥反應(yīng)、保護腎臟毛細(xì)血管網(wǎng)及腎小管上皮細(xì)胞、間接減少局部TGF-β1水平，發(fā)揮抗腎間質(zhì)纖維化作用。本結(jié)果揭示了骨化三醇通