Notch信號調(diào)控巨噬細(xì)胞參與腎纖維化的作用及機制研究.pdf

1、背景：
　　腎臟纖維化是各種慢性腎臟病發(fā)展為終末期腎病的最終共同途徑，一般需要腎臟替代治療，如得不到及時處理，甚至導(dǎo)致死亡。腎纖維化是炎癥損傷修復(fù)的反應(yīng)，各種腎臟損傷都能引起小管上皮細(xì)胞的變性壞死，同時伴隨著各種炎癥細(xì)胞浸潤和炎性因子釋放，導(dǎo)致成纖維細(xì)胞的激活和增生，最終造成促纖維化物質(zhì)的形成和ECM的大量堆積。前人對腎纖維化的病理生理機制進(jìn)行了大量的探索性研究，盡管取得了一系列階段性的成果，但對其發(fā)病機制仍不甚明了。
　　

2、從細(xì)胞層面講，腎臟自身細(xì)胞和骨髓來源的細(xì)胞共同參與腎損傷的進(jìn)展。腎臟損傷后炎癥介質(zhì)誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞浸潤到腎間質(zhì)，尤其是單核巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的先天免疫反應(yīng)尤為突出。以往研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞具有促纖維化作用，而近幾年研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞不僅發(fā)揮促纖維化角色，甚至還能改善腎纖維化。主要原因與巨噬細(xì)胞的異質(zhì)性有關(guān)。但關(guān)于巨噬細(xì)胞異質(zhì)性在腎纖維化中的作用和機制目前尚不清楚。大量的研究顯示多種信號通路參與調(diào)控巨噬細(xì)胞的活化，其中Notch信號是調(diào)控巨噬細(xì)胞活化的重

3、要信號通路之一，提示：Notch信號可能通過調(diào)控巨噬細(xì)胞的活化參與腎纖維化進(jìn)程。
　　Notch信號是進(jìn)化上高度保守的單次跨膜受體蛋白，當(dāng)機體受到外界刺激時，Notch信號介導(dǎo)細(xì)胞間的信息傳遞，參與調(diào)控細(xì)胞發(fā)育的一系列生物學(xué)行為。大量研究顯示Notch信號不僅參與腎小管、集合管發(fā)育，而且與腎纖維化的形成密切相關(guān)。最近研究顯示在小管上皮細(xì)胞特異性敲除Notch后纖維化程度減輕，提示：Notch信號可以促進(jìn)腎纖維化的進(jìn)展。已知腎纖維化

4、是個慢性炎癥損傷修復(fù)的過程，作為炎癥的起始應(yīng)答細(xì)胞的巨噬細(xì)胞在腎纖維化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。那么在巨噬細(xì)胞中特異性敲除或激活Notch信號通路是否影響纖維化的進(jìn)程是個令人感興趣的問題。
　　目的：
　　為了更全面的闡明Notch信號調(diào)控巨噬細(xì)胞參與腎纖維化的作用和機制，我們利用巨噬細(xì)胞特異性Notch信號敲除或激活的小鼠模型，在UUO誘導(dǎo)的腎纖維化模型中，利用分子生物學(xué)和免疫學(xué)方法，從分子、細(xì)胞和動物水平分析 Notch

5、信號調(diào)控巨噬細(xì)胞參與腎纖維化的作用和機制，以期為將來靶向巨噬細(xì)胞干預(yù)Notch信號進(jìn)行腎纖維化治療提供新靶點和新策略。
　　方法：
　　1.將對照小鼠（lyz2-cre/RBP-J+/flox）、巨噬細(xì)胞特異性RBP-J剔除小鼠（lyz2-cre/RBP-Jflox/flox）、巨噬細(xì)胞特異性激活Notch小鼠(lyz2-cre/STOPflox-NICD)的左側(cè)輸尿管結(jié)扎，建立UUO模型。
　　2.Masson、免疫

6、熒光染色、qRT-PCR檢測小鼠UUO模型中纖維化水平的變化。
　　3.H&E,qRT-PCR、ELISA檢測小鼠UUO模型中炎性細(xì)胞浸潤以及促炎促纖維化因子的變化。
　　4.免疫熒光染色、流式細(xì)胞術(shù)、qRT-PCR檢測巨噬細(xì)胞的浸潤及極化；qRT-PCR、免疫熒光染色檢測腎纖維化中巨噬細(xì)胞Notch信號的活化。
　　5.Western blot、qRT-PCR、體外共培養(yǎng)實驗檢測在巨噬細(xì)胞特異性阻斷RBP-J后腎小管

7、上皮細(xì)胞EMT的改變。
　　6.利用脂質(zhì)體包裹的氯磷酸鹽清除腎臟組織定居型巨噬細(xì)胞實驗，通過FACS、組織學(xué)染色檢測組織定居巨噬細(xì)胞對腎臟纖維化貢獻(xiàn)。
　　7.利用Brdu體內(nèi)參入實驗，通過FACS檢測巨噬細(xì)胞增殖對腎纖維化的貢獻(xiàn)。
　　結(jié)果：
　　1.成功建立UUO誘導(dǎo)的纖維化模型。
　　2.UUO第14天時纖維化程度和間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤都高于第7天；UUO后巨噬細(xì)胞浸潤明顯增多，且第7天和14天以M2型巨

8、噬細(xì)胞浸潤為主，然而UUO第7天和14天時M1型巨噬細(xì)胞的數(shù)量沒有顯著不同。
　　3.纖維化過程中巨噬細(xì)胞的Notch信號通路被激活。
　　4.巨噬細(xì)胞特異性敲除Notch信號后，腎臟纖維化程度減輕。表現(xiàn)在：Notch信號剔除后抑制了EMT發(fā)生和促纖維化因子釋放；減少了炎癥細(xì)胞浸潤和炎癥因子的釋放。
　　5.氯磷酸鹽清除腎臟原位巨噬細(xì)胞結(jié)果顯示：Notch主要通過影響骨髓來源的巨噬細(xì)胞參與腎纖維化；另外阻斷Notch信

9、號并不影響炎性巨噬細(xì)胞的增殖。
　　6.巨噬細(xì)胞特異性敲除Notch信號后，腎臟中巨噬細(xì)胞的浸潤減少，其中巨噬細(xì)胞中CCR2表達(dá)顯著減少；FACS結(jié)果顯示大量的CCR2+的單核-巨噬細(xì)胞被滯留在骨髓。
　　7.利用巨噬細(xì)胞特異性激活Notch的小鼠建立小鼠纖維化模型后，F(xiàn)ACS、組織學(xué)染色結(jié)果顯示：腎臟中CCR2+炎癥巨噬細(xì)胞的募集增多，腎臟纖維化水平加重。
　　結(jié)論：
　　1.UUO誘導(dǎo)的腎纖維化后期主要是M2