Notch信號通路對小鼠巨噬細(xì)胞功能調(diào)控的研究.pdf

1、巨噬細(xì)胞是重要的免疫細(xì)胞之一。巨噬細(xì)胞起源于骨髓造血干細(xì)胞，經(jīng)髓系祖細(xì)胞、單核細(xì)胞分化而來。巨噬細(xì)胞可以通過清除凋亡細(xì)胞和產(chǎn)生生長因子的方式參與內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持，調(diào)控骨的形態(tài)發(fā)生、管腔分支形成、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和新生血管形成。同時巨噬細(xì)胞活化是免疫應(yīng)答的重要環(huán)節(jié)，可以通過吞噬殺傷作用和產(chǎn)生炎性因子發(fā)揮先天免疫作用，也可以通過抗原呈遞功能啟動T細(xì)胞和B細(xì)胞介導(dǎo)獲得性免疫應(yīng)答，其分泌的多種細(xì)胞因子對先天免疫和獲得性免疫又具有調(diào)節(jié)作用。巨噬細(xì)胞功能異

2、常與腫瘤和肥胖等多種疾病密切相關(guān)，因而深入研究巨噬細(xì)胞發(fā)育和功能的調(diào)控，對于進(jìn)一步闡明穩(wěn)態(tài)維持和免疫應(yīng)答的發(fā)生機(jī)制，以及多種疾病的臨床治療都具有重要的意義。
　　Notch信號通路在進(jìn)化上高度保守，通過局部細(xì)胞間的相互作用以控制細(xì)胞命運，是調(diào)控胚胎發(fā)育和多種成體組織器官體內(nèi)穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞分化的重要信號通路。哺乳動物表達(dá)四個Notch受體（Notch1-4）和五個配體（Jagged1、Jagged2、和Delta-like-1、3、4）

3、。細(xì)胞表面的Notch受體與配體結(jié)合后，在蛋白水解作用下釋放胞內(nèi)段（NICD）轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子RBP-J相互作用，轉(zhuǎn)而募集轉(zhuǎn)錄共激活物，活化下游靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。
　　Notch信號通路是調(diào)控髓系造血細(xì)胞發(fā)育的重要途徑，在造血干細(xì)胞的自我更新和髓系細(xì)胞的定向分化中都具有重要作用。同時Notch信號通路參與多種免疫細(xì)胞功能的調(diào)控，包括T細(xì)胞、B細(xì)胞和DC等。目前的研究提示，Notch信號通路對單核巨噬細(xì)胞的發(fā)育和功能具有重

4、要的意義，但研究較少，而且結(jié)論不明確。因此，本課題同時應(yīng)用條件性RBP-J基因剔除小鼠模型和巨噬細(xì)胞系RAW264.7穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型，主要分析了Notch信號通路對巨噬細(xì)胞的增殖、抗原呈遞功能和巨噬細(xì)胞活化的影響。主要研究結(jié)果如下：
　　1.獲得了RBP-J條件性基因剔除小鼠，建立了小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Notch-1NICD和RBP-J（R218H）的細(xì)胞株。
　　通過對RBP-Jflox/wr和Mx-

5、Cre轉(zhuǎn)基因小鼠的繁育，獲得了足夠數(shù)量的的Mx-Cre-RBP-Jflox/wr和Mx-Cre-RBP-Jflox/flox轉(zhuǎn)基因小鼠，給予腹腔注射12次polyI:C誘導(dǎo)Cre重組酶的表達(dá)后，成功獲得了RBP-J基因剔除小鼠。應(yīng)用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7，經(jīng)G418篩選和單克隆化，建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株RAW-NIC和RAW-R218H，經(jīng)q-PCR檢測Notch通路下游基因HES-1表達(dá)水平證實，過表達(dá)Notch-1

6、胞內(nèi)段的RAW-NIC細(xì)胞可以有效激活Notch信號通路，而過表達(dá)RBP-J顯性負(fù)突變蛋白RBP-J(R218H)的RAW-R218H細(xì)胞Notch信號通路抑制，成功獲得了Notch信號通路活化和阻斷的巨噬細(xì)胞系。RBP-J基因剔除小鼠和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的獲得為后續(xù)研究建立了動物模型和細(xì)胞模型。
　　2.Notch信號通路阻斷后分化成熟的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞總數(shù)和比例無明顯異常，Notch信號通路體外不影響巨噬細(xì)胞系的生長和增殖。

7、>　　分離培養(yǎng)RBP-J剔除小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測CD11b和F4/80雙陽性細(xì)胞總數(shù)和比例，與對照小鼠相比，RBP-J剔除后小鼠腹腔巨噬細(xì)胞總數(shù)和比例都無明顯差別；應(yīng)用GSI體外阻斷WT小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的Notch通路后，腹腔巨噬細(xì)胞總數(shù)和比例也無明顯異常。應(yīng)用MTT法測定巨噬細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株的生長曲線，同時應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞分析周期，各組細(xì)胞均無明顯差異。這些結(jié)果表明，Notch信號阻斷并不影響小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分化產(chǎn)生的總數(shù)

8、和比例，Notch信號通路的體外活化或抑制并不影響巨噬細(xì)胞的生長和增殖。
　　3.Notch信號通路調(diào)控小鼠巨噬細(xì)胞的抗原呈遞功能，這一作用可能是通過調(diào)控共刺激分子CD80和CD86的表達(dá)介導(dǎo)的。
　　小鼠腹腔巨噬細(xì)胞在RBP-J基因剔除或應(yīng)用GSI體外阻斷Notch信號通路后，體外與CFSE標(biāo)記的初始T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，流式細(xì)胞術(shù)分析表明增殖的T細(xì)胞總數(shù)和比例顯著低于對照組。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Notch信號阻斷后腹腔巨噬細(xì)胞膜表

9、面共刺激分子CD80和CD86表達(dá)顯著減低。而且，巨噬細(xì)胞系Notch信號通路活化后，可以促進(jìn)更多的T細(xì)胞增殖。這些結(jié)果表明，Notch信號通路可能通過調(diào)控小鼠巨噬細(xì)胞膜表面共刺激分子CD80和CD86的表達(dá)，調(diào)控巨噬細(xì)胞的抗原呈遞功能。
　　4.Notch信號通路阻斷后，LPS不能誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞的經(jīng)典活化，Notch信號參與調(diào)控巨噬細(xì)胞對LPS應(yīng)答中多種炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生。
　　Notch信號通路參與LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞

10、活化，q-PCR證實LPS活化后，巨噬細(xì)胞多個Notch受體和配體的表達(dá)改變。RBP-J基因剔除或應(yīng)用GSI體外阻斷Notch信號通路后，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞對LPS的應(yīng)答改變，與對照相比，IL-12產(chǎn)生顯著減少，而IL-10產(chǎn)生輕度增加，不能活化為M1型巨噬細(xì)胞，而接近M2巨噬細(xì)胞的表型。此外，Notch信號通路可以促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α和iNOS，抑制IL-1β的產(chǎn)生，阻斷Notch信號后IL-6的產(chǎn)生增多。這些結(jié)果表明

11、，LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞經(jīng)典活化過程中依賴Notch通路的作用，Notch信號的缺失導(dǎo)致巨噬細(xì)胞M1型活化障礙，而Notch信號通路與LPS共同調(diào)控巨噬細(xì)胞多種炎性因子的產(chǎn)生。
　　5.Notch信號通路調(diào)控巨噬細(xì)胞CD11b的表達(dá)。
　　通過剔除RBP-J或體外應(yīng)用GSI阻斷小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的Notch信號通路，巨噬細(xì)胞表達(dá)的CD11b在蛋白水平和mRNA水平均顯著減低；活化巨噬細(xì)胞系的Notch信號通路可以上調(diào)CD11bmR

12、NA水平和蛋白水平的表達(dá)。進(jìn)一步將小鼠CD11b啟動子區(qū)克隆構(gòu)建基因報告質(zhì)粒，通過報告基因?qū)嶒炞C實，Notch信號通路對CD11b基因的轉(zhuǎn)錄無直接調(diào)控作用，可能通過間接作用調(diào)控CD11b的表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　通過本課題的研究證實，Notch信號通路可以調(diào)控巨噬細(xì)胞的多種生物學(xué)特征。巨噬細(xì)胞發(fā)育過程中，Notch信號通路的阻斷不影響小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分化產(chǎn)生的細(xì)胞總數(shù)和比例，體外實驗中Notch信號通路不調(diào)控巨噬細(xì)胞的生長和

13、增殖。然而，Notch信號通路可以調(diào)控小鼠巨噬細(xì)胞的抗原呈遞功能，這一作用可能是通過調(diào)控共刺激分子CD80和CD86的表達(dá)介導(dǎo)的。LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞經(jīng)典活化過程中依賴Notch通路的作用，Notch信號的缺失導(dǎo)致巨噬細(xì)胞M1型活化障礙，而且Notch信號通路與LPS共同調(diào)控巨噬細(xì)胞多種炎性因子的產(chǎn)生。此外，Notch信號通路還可能通過間接作用調(diào)控巨噬細(xì)胞膜表面重要標(biāo)記分子CD11b的表達(dá)，這一作用可能成為Notch信號途徑參與調(diào)控巨噬細(xì)