NOTCH-1信號(hào)通路對(duì)腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖與分化調(diào)控作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、膠質(zhì)瘤是常見(jiàn)的一種原發(fā)于神經(jīng)系統(tǒng)的惡性腫瘤，是治療效果最差的腫瘤之一。最大的難點(diǎn)在于復(fù)發(fā)，這與膠質(zhì)瘤細(xì)胞的無(wú)限增殖能力和侵襲性生長(zhǎng)有關(guān)。近期發(fā)現(xiàn)腦膠質(zhì)瘤中存在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，但僅占細(xì)胞成分中的少部分。它具有能自我更新和增殖、分化能力，是形成不同分化程度膠質(zhì)瘤細(xì)胞的“種子”細(xì)胞，在膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展和復(fù)發(fā)中起決定性作用。 近年來(lái)通過(guò)對(duì)NOTCH-1信號(hào)通路的深入研究，發(fā)現(xiàn)NOTCH-1信號(hào)的異常與人類腫瘤形成有密切的聯(lián)系。在多種組織

2、腫瘤中均發(fā)現(xiàn)NOTCH-1信號(hào)通路的異常激活。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中NOTCH-1信號(hào)通路的異常激活可能導(dǎo)致腦腫瘤形成。NOTCH-1信號(hào)通路在腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生中起重要作用，一些膠質(zhì)瘤和髓母細(xì)胞瘤以及相應(yīng)的模型系統(tǒng)的維持和存活需要NOTCH-1信號(hào)通路信號(hào)；NOTCH-1信號(hào)通路可能參與了膠質(zhì)瘤的啟動(dòng)，而且通常作用于神經(jīng)前體細(xì)胞或有神經(jīng)干細(xì)胞特性的細(xì)胞。NOTCH信號(hào)通路通過(guò)NOTCH-HES信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)抑制神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞，從

3、而間接維持神經(jīng)干細(xì)胞的未分化狀態(tài)和自我更新。在此過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵的作用的是堿性螺旋-環(huán)-螺旋(basic-helix-loop-helix，bHLH)基因。NOTCH-1信號(hào)也可通過(guò)細(xì)胞周期因子、抗凋亡因子調(diào)控，或與其他信號(hào)通路如SHH通路協(xié)同，發(fā)揮調(diào)控作用，從而影響腫瘤細(xì)胞的增殖和存活。 鑒于NOTCH-1信號(hào)通路在NSC或神經(jīng)前體細(xì)胞的自我更新、增殖及分化中起重要作用，而在包括髓母細(xì)胞瘤在內(nèi)的膠質(zhì)瘤和其它多種腫瘤組織及細(xì)胞系中

4、也發(fā)現(xiàn)NOTCH-1信號(hào)通路的異常活化，我們推測(cè)在膠質(zhì)瘤的種子細(xì)胞膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中應(yīng)該也有NOTCH-1信號(hào)的異常變化，并可能對(duì)膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展起重要作用，但是究竟如何變化?這些變化又是通過(guò)何種機(jī)制決定膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的命運(yùn)及調(diào)控其增殖、分化等生物學(xué)行為?目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)導(dǎo)，值得進(jìn)一步深入研究。 在第一部分實(shí)驗(yàn)中，采用以CD133為標(biāo)志，用免疫磁珠法從人腦膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞株中分離腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞并進(jìn)行體外培養(yǎng)，通過(guò)免疫熒光技術(shù)檢測(cè)干

5、細(xì)胞標(biāo)志物CD133、Nestin，誘導(dǎo)分化后檢查分化細(xì)胞標(biāo)志物MAP2、GFAP、MBP以及電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察和移植SCID鼠致瘤實(shí)驗(yàn)，對(duì)其干細(xì)胞特性加以鑒定，得到如下結(jié)果： 不同病理分級(jí)的新鮮膠質(zhì)瘤標(biāo)本和膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中存在一小部分CD133+的膠質(zhì)瘤細(xì)胞，能表達(dá)干細(xì)胞的標(biāo)志物CD133和Nestin，符合干細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，體外培養(yǎng)能連續(xù)傳代；具有多向分化潛能：誘導(dǎo)分化后能產(chǎn)生MAP2、β-TubulinⅢ、GFAP、MBP

6、染色陽(yáng)性的細(xì)胞；移植SCID鼠后能形成與親本腫瘤表型一致的移植瘤。因此，這一小部分CD133+膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有干細(xì)胞的屬性，就是膠質(zhì)瘤中的腫瘤干細(xì)胞，即膠質(zhì)瘤干細(xì)胞。 在第二部分實(shí)驗(yàn)中，采用體外分離培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞作為細(xì)胞模型，研究膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖、分化培養(yǎng)過(guò)程中NOTCH-1信號(hào)通路基因和蛋白的表達(dá)情況，以及腦膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞株中的蛋白表達(dá)情況及細(xì)胞類型，并分析與腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖、分化的關(guān)系。應(yīng)用免疫熒光技術(shù)、RT-PCR、

7、WesternBlot和流式細(xì)胞術(shù)等檢測(cè)對(duì)體外培養(yǎng)的腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖、分化、得到如下結(jié)果： 1、腦膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞株中有NOTCH-1和HES-1表達(dá)，而正常成人腦組織中僅能檢測(cè)到微弱的表達(dá)；NOTCH-1和HES-1在高級(jí)別膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)強(qiáng)于低級(jí)別膠質(zhì)瘤組織中。 2、NOTCH-1和HES-1在CD133、MAP2、GFAP和MBP陽(yáng)性細(xì)胞中均可表達(dá)，但在CD133陽(yáng)性細(xì)胞中有很強(qiáng)的表達(dá)，而在發(fā)育較成熟的MAP2

8、、GFAP和MBP陽(yáng)性細(xì)胞中表達(dá)減弱或極弱檢測(cè)不到，提示NOTCH-1和HES-1的表達(dá)強(qiáng)弱可能參與了膠質(zhì)瘤細(xì)胞未分化狀態(tài)的維持和分化的調(diào)控。 3、膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖過(guò)程均能檢測(cè)到較強(qiáng)的NOTCH-1信號(hào)通路基因mRNA和蛋白表達(dá)，提示NOTCH-1信號(hào)通路的強(qiáng)表達(dá)可能參與了腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖過(guò)程的調(diào)控和干細(xì)胞狀態(tài)的維持。 4、膠質(zhì)瘤干細(xì)胞分化時(shí)NOTCH-1信號(hào)通路基因mRNA和蛋白表達(dá)逐漸減弱，CD133表達(dá)逐漸減弱，

9、MAP2、GFAP和MBP出現(xiàn)表達(dá)并逐漸增強(qiáng)，提示NOTCH-1信號(hào)通路表達(dá)減弱可能參與了膠質(zhì)瘤干細(xì)胞分化的調(diào)控。 在第三部分實(shí)驗(yàn)中，在第二部分的基礎(chǔ)上構(gòu)建了針對(duì)人NOTCH-1基因的RNA干擾逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，應(yīng)用RNAi技術(shù)抑制腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中NOTCH-1信號(hào)通路的表達(dá)和作用，分析NOTCH-1信號(hào)通路對(duì)腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖與分化的調(diào)控作用，得到如下結(jié)果： 1、成功構(gòu)建了pSiRNA-NOTCH-1和pSiRNA-NC

10、，并經(jīng)PT67細(xì)胞包裝后生成了相應(yīng)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。 2、對(duì)NOTCH-1信號(hào)通路進(jìn)行RNAi后，膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖受到抑制，存活細(xì)胞減少；G0/G1期細(xì)胞減少，G2/M期細(xì)胞增加，凋亡/壞死細(xì)胞增加，提示NOTCH-1信號(hào)通路對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖、細(xì)胞分裂和存活有促進(jìn)作用，該作用可能是通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期以促進(jìn)細(xì)胞分裂、減少細(xì)胞凋亡/壞死實(shí)現(xiàn)的。 3、對(duì)NOTCH-1信號(hào)通路RNAi后，腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞分化受到抑制，死亡細(xì)胞明顯

11、增加，說(shuō)明NOTCH-1信號(hào)通路促進(jìn)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞分化和存活。 總之，通過(guò)本課題的研究，結(jié)果表明：NOTCH-1信號(hào)通路的基因和蛋白在腦膠質(zhì)瘤的增殖、分化和存活的過(guò)程中同樣表達(dá)并發(fā)揮重要的調(diào)控作用，不僅促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的增殖和存活，同樣也促進(jìn)并調(diào)控腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的分化過(guò)程和存活，該作用可能是通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期以促進(jìn)細(xì)胞分裂、減少細(xì)胞凋亡、壞死實(shí)現(xiàn)的。 我們也應(yīng)該看到，NOTCH-1信號(hào)僅僅是膠質(zhì)瘤增殖、分化和存活中起關(guān)鍵作