重組人IL-24對膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖、分化的影響.pdf

1、膠質(zhì)瘤是人類最常見的顱腦腫瘤,傳統(tǒng)的治療方法包括手術(shù)、放療和化療,治療效果有限。研究發(fā)現(xiàn)腦腫瘤干細(xì)胞(brain tumor stem cell,BTSC)的存在是膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的主要原因,以BTSC為治療靶細(xì)胞,尤其是誘導(dǎo)BTSC的分化治療為膠質(zhì)瘤治療提供了新途徑。白介素-24(Interleukin-24,IL-24)是近年發(fā)現(xiàn)的、具有細(xì)胞因子樣特性的腫瘤抑制基因,具有抑制腫瘤生長、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的廣譜抗腫瘤活性。最近研究發(fā)現(xiàn)IL-

2、24在造血系統(tǒng)惡性腫瘤中能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞向成熟單核-巨噬系分化。IL-24對腫瘤干細(xì)胞的增殖和分化的影響尚未見報(bào)道。因此,本課題擬研究IL-24對BTSC增殖和分化的作用,本研究分以下三部分闡述:
　　第一部分IL-24表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及重組蛋白的表達(dá)、純化
　　目的:構(gòu)建白介素-24(Interleukin-24,IL-24)的原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a-IL24,利用其轉(zhuǎn)化BL21(DE3)菌株,表達(dá)重組蛋白IL-24,通過

3、鑒定、純化、復(fù)性獲得重組蛋白IL-24。
　　方法:利用分子生物學(xué)技術(shù),將IL-24的cDNA插入到表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+),通過酶切、測序鑒定重組載體。鑒定正確重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌株BL21(DE3)進(jìn)行蛋白表達(dá),SDS-PAGE電泳和Western Blotting鑒定,確定目的蛋白的表達(dá)。通過重組工程菌的誘導(dǎo)培養(yǎng),獲得重組蛋白IL-24包涵體。洗滌后利用目的蛋白攜帶的6×His純化標(biāo)簽,采用鎳離子親合層析純化蛋白IL-24。通過

4、透析復(fù)性使目的蛋白正確折疊。
　　結(jié)果:成功構(gòu)建IL-24表達(dá)質(zhì)粒pET28a-IL24,DNA測序結(jié)果顯示,IL-24序列與Genebank(NCBI Reference Sequence:NG_029565.1)序列完全吻合。重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-IL24轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株后,經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng),收獲菌體總蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳并考馬斯亮藍(lán)染色后,分析表達(dá)目的蛋白IL-24約占菌體總蛋白的36.47％,且目的蛋白的表達(dá)形式主要為包涵

5、體。洗滌溶解后采用鎳離子親合層析得到純度為90%以上的重組人IL-24(Recombinant Human Interleukin-24,rhIL-24)。復(fù)性的rhIL-24蛋白冷凍抽干后-20℃保存。
　　結(jié)論:成功構(gòu)建IL-24的原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a-IL24,在大腸桿菌高效表達(dá)重組蛋白IL-24,采用鎳離子親合層析法獲得rhIL-24,為下一步實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。
　　第二部分膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251中腦腫瘤干細(xì)胞的分選、鑒

6、定
　　目的:采用無血清懸浮培養(yǎng)和免疫磁珠分選相結(jié)合的方法進(jìn)行人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞系中腦腫瘤干細(xì)胞(brain tumor stem cell,BTSC)的分選,并鑒定。
　　方法:首先將U251細(xì)胞接種于含有生長因子的無血清培養(yǎng)基,通過懸浮培養(yǎng)法得到含有大量BTSC的腦腫瘤干細(xì)胞球。細(xì)胞免疫熒光檢測CD133和Nestin在腦腫瘤干細(xì)胞球上的表達(dá)。分離腦腫瘤干細(xì)胞球中的BTSC,運(yùn)用CD133標(biāo)記的免疫磁珠對BTSC進(jìn)行

7、分選和純化,并用流式細(xì)胞儀檢測分選后BTSC的CD133表達(dá)陽性率。通過MTT法和細(xì)胞單克隆形成率實(shí)驗(yàn)檢測分選的CD133+的BTSC的增殖活性。
　　結(jié)果:U251細(xì)胞在含血清的培養(yǎng)液中呈貼壁生長,增殖活躍。U251細(xì)胞接種于無血清培養(yǎng)基后,24至48小時(shí)內(nèi)大部分細(xì)胞貼壁,一部分細(xì)胞呈單細(xì)胞懸浮狀態(tài);并有一部分細(xì)胞發(fā)生非特異聚集。培養(yǎng)72小時(shí)后開始形成細(xì)胞球,懸浮于培養(yǎng)基中,隨后細(xì)胞球逐漸增大,形成典型的腦腫瘤干細(xì)胞球。細(xì)胞免疫

8、熒光檢測顯示CD133和Nestin在腦腫瘤干細(xì)胞球上的高表達(dá)。利用免疫磁珠分選技術(shù)純化CD133+細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測腦腫瘤干細(xì)胞球中的細(xì)胞經(jīng)分選后,CD133+細(xì)胞比例達(dá)到95.8%。MTT檢測發(fā)現(xiàn)CD133+細(xì)胞的增殖能力顯著強(qiáng)于CD133-細(xì)胞;同時(shí)CD133+細(xì)胞單克隆形成率高,而CD133-細(xì)胞幾乎不能形成典型的腦腫瘤干細(xì)胞球。
　　結(jié)論:U251經(jīng)含有生長因子的無血清培養(yǎng)液懸浮培養(yǎng)后,能夠形成典型的腦腫瘤干細(xì)胞球,且

9、CD133+細(xì)胞比例顯著增高。利用免疫磁珠分選技術(shù)從腦腫瘤干細(xì)胞球中分選獲得高純度的CD133+細(xì)胞,且其增殖能力強(qiáng)。
　　第三部分rhIL-24對膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖、分化的影響
　　目的:研究rhIL-24對CD133+的BTSC的增殖和分化的影響。
　　方法:通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測CD133+BTSC在經(jīng)rhIL-24治療后細(xì)胞的增殖活性;通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及細(xì)胞免疫熒光檢測NeuN和GFAP的表達(dá)研究rhIL-24對C

10、D133+BTSC分化的影響;流式細(xì)胞分析研究rhIL-24對CD133+BTSC中CD133表達(dá)的影響;裸鼠移植瘤成瘤實(shí)驗(yàn),觀察rhIL-24治療后的CD133+BTSC成瘤能力。
　　結(jié)果:MTT實(shí)驗(yàn)顯示rhIL-24能夠顯著抑制CD133+BTSC的增殖。經(jīng)rhIL-24誘導(dǎo)培養(yǎng)的CD133+BTSC在含生長因子的無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)7天后,細(xì)胞形態(tài)多樣,突起增多變長;神經(jīng)元標(biāo)記物NeuN和星形細(xì)胞標(biāo)記物GFAP的表達(dá)顯著增高