重組人IL-24對膠質(zhì)瘤干細胞增殖、分化的影響.pdf

1、膠質(zhì)瘤是人類最常見的顱腦腫瘤,傳統(tǒng)的治療方法包括手術、放療和化療,治療效果有限。研究發(fā)現(xiàn)腦腫瘤干細胞(brain tumor stem cell,BTSC)的存在是膠質(zhì)瘤復發(fā)、轉(zhuǎn)移的主要原因,以BTSC為治療靶細胞,尤其是誘導BTSC的分化治療為膠質(zhì)瘤治療提供了新途徑。白介素-24(Interleukin-24,IL-24)是近年發(fā)現(xiàn)的、具有細胞因子樣特性的腫瘤抑制基因,具有抑制腫瘤生長、誘導細胞凋亡的廣譜抗腫瘤活性。最近研究發(fā)現(xiàn)IL-

2、24在造血系統(tǒng)惡性腫瘤中能夠誘導腫瘤細胞向成熟單核-巨噬系分化。IL-24對腫瘤干細胞的增殖和分化的影響尚未見報道。因此,本課題擬研究IL-24對BTSC增殖和分化的作用,本研究分以下三部分闡述:
　　第一部分IL-24表達質(zhì)粒的構(gòu)建及重組蛋白的表達、純化
　　目的:構(gòu)建白介素-24(Interleukin-24,IL-24)的原核表達質(zhì)粒pET28a-IL24,利用其轉(zhuǎn)化BL21(DE3)菌株,表達重組蛋白IL-24,通過

3、鑒定、純化、復性獲得重組蛋白IL-24。
　　方法:利用分子生物學技術,將IL-24的cDNA插入到表達質(zhì)粒pET28a(+),通過酶切、測序鑒定重組載體。鑒定正確重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌株BL21(DE3)進行蛋白表達,SDS-PAGE電泳和Western Blotting鑒定,確定目的蛋白的表達。通過重組工程菌的誘導培養(yǎng),獲得重組蛋白IL-24包涵體。洗滌后利用目的蛋白攜帶的6×His純化標簽,采用鎳離子親合層析純化蛋白IL-24。通過

4、透析復性使目的蛋白正確折疊。
　　結(jié)果:成功構(gòu)建IL-24表達質(zhì)粒pET28a-IL24,DNA測序結(jié)果顯示,IL-24序列與Genebank(NCBI Reference Sequence:NG_029565.1)序列完全吻合。重組表達質(zhì)粒pET28a-IL24轉(zhuǎn)化表達菌株后,經(jīng)誘導培養(yǎng),收獲菌體總蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳并考馬斯亮藍染色后,分析表達目的蛋白IL-24約占菌體總蛋白的36.47％,且目的蛋白的表達形式主要為包涵

5、體。洗滌溶解后采用鎳離子親合層析得到純度為90%以上的重組人IL-24(Recombinant Human Interleukin-24,rhIL-24)。復性的rhIL-24蛋白冷凍抽干后-20℃保存。
　　結(jié)論:成功構(gòu)建IL-24的原核表達質(zhì)粒pET28a-IL24,在大腸桿菌高效表達重組蛋白IL-24,采用鎳離子親合層析法獲得rhIL-24,為下一步實驗奠定基礎。
　　第二部分膠質(zhì)瘤細胞U251中腦腫瘤干細胞的分選、鑒

6、定
　　目的:采用無血清懸浮培養(yǎng)和免疫磁珠分選相結(jié)合的方法進行人腦膠質(zhì)瘤U251細胞系中腦腫瘤干細胞(brain tumor stem cell,BTSC)的分選,并鑒定。
　　方法:首先將U251細胞接種于含有生長因子的無血清培養(yǎng)基,通過懸浮培養(yǎng)法得到含有大量BTSC的腦腫瘤干細胞球。細胞免疫熒光檢測CD133和Nestin在腦腫瘤干細胞球上的表達。分離腦腫瘤干細胞球中的BTSC,運用CD133標記的免疫磁珠對BTSC進行

7、分選和純化,并用流式細胞儀檢測分選后BTSC的CD133表達陽性率。通過MTT法和細胞單克隆形成率實驗檢測分選的CD133+的BTSC的增殖活性。
　　結(jié)果:U251細胞在含血清的培養(yǎng)液中呈貼壁生長,增殖活躍。U251細胞接種于無血清培養(yǎng)基后,24至48小時內(nèi)大部分細胞貼壁,一部分細胞呈單細胞懸浮狀態(tài);并有一部分細胞發(fā)生非特異聚集。培養(yǎng)72小時后開始形成細胞球,懸浮于培養(yǎng)基中,隨后細胞球逐漸增大,形成典型的腦腫瘤干細胞球。細胞免疫

8、熒光檢測顯示CD133和Nestin在腦腫瘤干細胞球上的高表達。利用免疫磁珠分選技術純化CD133+細胞,流式細胞儀檢測腦腫瘤干細胞球中的細胞經(jīng)分選后,CD133+細胞比例達到95.8%。MTT檢測發(fā)現(xiàn)CD133+細胞的增殖能力顯著強于CD133-細胞;同時CD133+細胞單克隆形成率高,而CD133-細胞幾乎不能形成典型的腦腫瘤干細胞球。
　　結(jié)論:U251經(jīng)含有生長因子的無血清培養(yǎng)液懸浮培養(yǎng)后,能夠形成典型的腦腫瘤干細胞球,且

9、CD133+細胞比例顯著增高。利用免疫磁珠分選技術從腦腫瘤干細胞球中分選獲得高純度的CD133+細胞,且其增殖能力強。
　　第三部分rhIL-24對膠質(zhì)瘤干細胞增殖、分化的影響
　　目的:研究rhIL-24對CD133+的BTSC的增殖和分化的影響。
　　方法:通過MTT實驗檢測CD133+BTSC在經(jīng)rhIL-24治療后細胞的增殖活性;通過細胞形態(tài)學觀察及細胞免疫熒光檢測NeuN和GFAP的表達研究rhIL-24對C

10、D133+BTSC分化的影響;流式細胞分析研究rhIL-24對CD133+BTSC中CD133表達的影響;裸鼠移植瘤成瘤實驗,觀察rhIL-24治療后的CD133+BTSC成瘤能力。
　　結(jié)果:MTT實驗顯示rhIL-24能夠顯著抑制CD133+BTSC的增殖。經(jīng)rhIL-24誘導培養(yǎng)的CD133+BTSC在含生長因子的無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)7天后,細胞形態(tài)多樣,突起增多變長;神經(jīng)元標記物NeuN和星形細胞標記物GFAP的表達顯著增高