重組人IL-24腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及對(duì)喉腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng).pdf

1、背景與目的：喉癌是耳鼻咽喉科常見(jiàn)的惡性腫瘤,約90％以上是鱗狀細(xì)胞癌。喉癌的發(fā)病率在近幾年有上升的趨勢(shì),這與診斷水平的提高、生活習(xí)慣改變以及空氣污染都有關(guān)系。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示:喉癌的發(fā)病率在城市高于農(nóng)村,在重工業(yè)發(fā)達(dá)的城市高于輕工業(yè)發(fā)達(dá)城市。手術(shù)治療是喉癌最常用的治療手段,隨著頭頸外科的發(fā)展,喉外科手術(shù)不斷完善,患者的5年生存率及生存質(zhì)量明顯提高。但仍有30％-40％的患者,在經(jīng)過(guò)根治手術(shù)和放化療治療后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。當(dāng)出現(xiàn)復(fù)發(fā)和/或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移時(shí)

2、患者對(duì)放化療多不敏感,3年生存率僅為10％。因此如何進(jìn)一步提高喉癌的療效成為當(dāng)務(wù)之急。隨著分子生物學(xué)和基因工程的飛速發(fā)展,基因免疫治療日益受到重視,顯示出良好的發(fā)展前景。
　　 白細(xì)胞介素24,又名黑色素瘤分化相關(guān)抗原7(melanoma differentiation associatedantigen7,MDA-7),它主要由CD3+T淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞表達(dá),為分泌型蛋白,屬于IL-10家族成員。研究顯示IL-24是目前發(fā)現(xiàn)

3、唯一一種既具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和血管形成又具有免疫刺激作用的細(xì)胞因子。這種抑制作用并不依賴(lài)p53、Rb和p16等抑癌基因,對(duì)正常細(xì)胞幾乎無(wú)影響?，F(xiàn)已成為腫瘤治療研究熱點(diǎn)。
　　 mda-7/IL-24對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有抑制作用,但尚不清楚它對(duì)喉癌細(xì)胞是否具有相似的作用。為此我們對(duì)其進(jìn)行了克隆,通過(guò)腺病毒介導(dǎo)進(jìn)行體外過(guò)量表達(dá),觀察對(duì)喉癌細(xì)胞Hep2增殖的影響并對(duì)作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。具體工作如下:
　　 方法:
　　

4、 1.利用PHA刺激培養(yǎng)人外周血淋巴細(xì)胞使其表達(dá)IL-24基因,采用RT-PCR方法得到mda-7/IL-24編碼的cDNA。構(gòu)建T克隆載體Peasy-T1 Simpie-IL-24。
　　 2.從T克隆載體Peasy-T1 Simple-IL-24中大量擴(kuò)增mda-7/IL-24,酶切回收目的片段插入到pAdTrack-CMV穿梭質(zhì)粒中,與pAdEasy骨架質(zhì)粒在E.coli BJ5183中進(jìn)行同源重組為腺病毒載體質(zhì)粒,線(xiàn)形化

5、后轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞進(jìn)行包裝。TCID50方法測(cè)得病毒效價(jià)、PCR和Western-blot鑒定重組腺病毒Ad-mda-7/IL-24。
　　 3.Ad-mda-7/IL-24感染喉癌細(xì)胞及相關(guān)生物學(xué)檢測(cè):Ad-mda-7/IL-24和Adv分別感染人喉癌細(xì)胞Hep2,MTT觀察Ad-mda-7/IL-24對(duì)人喉癌細(xì)胞Hep2的增殖影響,RT-PCR法檢測(cè)感染后相關(guān)基因mRNA表達(dá)情況,Western-blot檢測(cè)感染后相關(guān)蛋白表

6、達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1.通過(guò)RT-PCR從PHA刺激培養(yǎng)的人外周血淋巴細(xì)胞中克隆出mda-7/IL-24編碼cDNA。構(gòu)建T克隆載體Peasy-T1 Simple-IL-24成功。經(jīng)酶切和測(cè)序驗(yàn)證為正確的IL-24 cDNA。
　　 2.經(jīng)基因重組技術(shù)獲得腺病毒表達(dá)相關(guān)的一系列載體,穿梭質(zhì)粒pAdTrackCMV-mda-7/IL-24、含目的基因的腺病毒質(zhì)粒pAd-mda-7/IL-24和空載體腺病毒質(zhì)粒

7、pAd,經(jīng)酶切和測(cè)序驗(yàn)證正確。成功構(gòu)建了腺病毒表達(dá)系列載體。質(zhì)粒線(xiàn)性化后經(jīng)脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞后,能夠在熒光顯微鏡下發(fā)出綠色熒光,RT-PCR檢測(cè)出IL-24 mRNA的表達(dá),Western Blot鑒定有目的蛋白IL-24的表達(dá)。
　　 3.Ad-mda-7/IL-24感染Hep2細(xì)胞后對(duì)Hep2細(xì)胞的增殖活性有較強(qiáng)抑制作用:凋亡相關(guān)分子Fas、BAX、Caspase-3表達(dá)有明顯增強(qiáng),BCL-2表達(dá)則下降。
　　

8、 結(jié)論:
　　 腫瘤治療的主要目的就是抑制腫瘤的生長(zhǎng)和改善患者的預(yù)后,基礎(chǔ)研究的首要任務(wù)則為闡明腫瘤的發(fā)生機(jī)制以及腫瘤治療基因的功能機(jī)制。本研究通過(guò)克隆腫瘤抑制基因mda-7/IL-24,并構(gòu)建重組腺病毒載體包裝含目的基因的腺病毒以揭示其過(guò)表達(dá)對(duì)喉癌細(xì)胞的作用,并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。結(jié)果顯示,成功構(gòu)建了含目的基因IL-24的腺病毒表達(dá)載體,并且病毒包裝成功。證明IL-24對(duì)喉癌細(xì)胞Hep2的增殖有較明顯的抑制作用,這種抑制