腺病毒介導(dǎo)IL-24基因?qū)251膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷作用及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、神經(jīng)膠質(zhì)瘤是人類最常見的腦部腫瘤，已成為15歲以下兒童腫瘤致死的第二大病因，是導(dǎo)致35～54歲成年男性和15～34歲女性腫瘤死亡的第四大病因。目前，惡性膠質(zhì)瘤的常規(guī)治療手段（手術(shù)加放化療）治療困難、遠(yuǎn)期效果差，死亡率高。對(duì)于惡性程度高的膠質(zhì)瘤患者，生存期短、5年生存率小于1％。怎樣改善膠質(zhì)瘤的治療效果，是臨床面對(duì)的一個(gè)難題。近年來，隨著分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)的研究進(jìn)展，對(duì)于腫瘤的基因治療方面取得了長(zhǎng)足進(jìn)步，為提高惡性膠質(zhì)瘤的治療效果，增

2、加患者的生存率開拓了新的思路。
　　 白細(xì)胞介素24（IL-24）是細(xì)胞因子白介素10家族的新成員，由于最初在人類黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)，因此也被稱為黑色素瘤分化相關(guān)因子-7（mda-7）基因。研究發(fā)現(xiàn)，IL-24對(duì)多種腫瘤細(xì)胞（肺癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、肝癌等）均有選擇性的抑制作用。此外，IL-24與化療、放療相結(jié)合的研究表明，將IL-24基因轉(zhuǎn)染入人非小細(xì)胞肺癌的細(xì)胞后，可增強(qiáng)此腫瘤細(xì)胞對(duì)放射治療的敏感性，而同時(shí)接受照

3、射的人正常成纖維細(xì)胞則未受此放射線照射的影響。由于IL-24特有的殺傷腫瘤細(xì)胞，而對(duì)正常細(xì)胞沒有損傷作用的生物學(xué)特點(diǎn)，現(xiàn)已成為基因治療的候選基因，并成功用于1期臨床研究。目前，關(guān)于IL-24對(duì)膠質(zhì)瘤作用的研究報(bào)道尚少，尤其對(duì)于IL-24誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制尚缺乏足夠的了解。
　　 本研究應(yīng)用新型重組腺病毒載體（Ad5F35-IL24），將IL-24基因?qū)肴四z質(zhì)瘤U251細(xì)胞，應(yīng)用MTT、流式細(xì)胞術(shù)、雙熒光染色、Hoec

4、hst33258熒光染色、Annexin V-FITC凋亡試劑盒和單細(xì)胞凝膠電泳（SCGE）等技術(shù)，體外觀察Ad5F35-IL24對(duì)U251細(xì)胞的殺傷作用。同時(shí)用transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)（Cell scratch assay）檢測(cè)藥物作用后腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移能力的改變。應(yīng)用Western blot印跡檢測(cè)外源性IL-24基因轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞后， ERK、p-ERK、p38 MAPK和p-p38 MAPK等細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

5、通路蛋白的表達(dá)水平變化。同時(shí)應(yīng)用MTT、流式細(xì)胞術(shù)、雙熒光染色觀察ERK、p38 MAPK蛋白抑制劑PD98059、SB203580作用后，對(duì)IL-24基因介導(dǎo)U251細(xì)胞殺傷中作用的影響。應(yīng)用Western blot印跡、RT-PCR、流式細(xì)胞術(shù)、免疫細(xì)胞化學(xué)的方法檢測(cè)bcl-2、caspase-3和TopoⅡα蛋白的表達(dá)變化情況。以期更深入的了解IL-24基因可能的效應(yīng)途徑和作用靶點(diǎn)，為進(jìn)一步提高臨床神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療效果提供研究基礎(chǔ)。

6、
　　 第一部分 Ad5F35-IL24重組腺病毒載體的構(gòu)建
　　 目的：構(gòu)建重組腺病毒載體.Ad5F35-IL24。
　　 方法：先用HindⅢ和SalⅠ雙酶切ATCC質(zhì)粒，得到目的條帶，然后再用HindⅢ和SalⅠ雙酶切pDC316質(zhì)粒，得到線性化的載體條帶，進(jìn)行片斷連接，轉(zhuǎn)化，篩選得到重組的pDC316-IL24質(zhì)粒。隨后用PCR和酶切的方法對(duì)重組pDC316-IL24質(zhì)粒進(jìn)行鑒定；最后經(jīng)全自動(dòng)核酸分析儀上

7、進(jìn)行序列測(cè)定證實(shí)連接正確。制備感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行轉(zhuǎn)化，大量制備質(zhì)粒DNA；之后用雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，產(chǎn)生重組腺病毒Ad5F35-IL24。進(jìn)行病毒擴(kuò)增、純化，計(jì)算病毒滴度，按照公式：病毒滴度（PFU/mL）=GFP陽性細(xì)胞數(shù)×病毒上清稀釋倍數(shù)/0.5 mL。
　　 結(jié)果：成功構(gòu)建載有IL-24基因的重組pDC316-IL24質(zhì)粒，并用PCR、酶切、序列測(cè)定和BLAST的方法進(jìn)行了鑒定，證明連接正確；獲得了攜帶IL-24基因的大

8、腸桿菌菌株；成功構(gòu)建成載有IL-24基因的增殖能力缺陷的新型重組腺病毒Ad5F35-IL24，并進(jìn)行了擴(kuò)增和純化。測(cè)得病毒滴度為2.8×108PFU/mL。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建攜帶IL-24基因，具有增殖能力缺陷的新型重組腺病毒Ad5F35-IL24載體。
　　 第二部分腺病毒介導(dǎo)IL-24基因?qū)251膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲、遷移及殺傷作用
　　 目的：觀察IL-24基因?qū)251人膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷作用，及其對(duì)腫瘤

9、細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響。
　　 方法：用MTT、流式細(xì)胞術(shù)、雙熒光染色、Hoechst33258熒光染色、Annexin V-FITC凋亡試劑盒和單細(xì)胞凝膠電泳（SCGE）等技術(shù)，觀察Ad5F35-IL24對(duì)U251細(xì)胞的殺傷作用。同時(shí)用transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)（Cell scratch assay），檢測(cè)藥物作用后對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響。
　　 結(jié)果：與空白對(duì)照組和空載體組相比，Ad5F3

10、5-IL24能夠抑制人U251細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且隨著Ad5F35-IL24藥物濃度的增加，細(xì)胞殺傷率增加明顯。結(jié)果表明，Ad5F35-IL24對(duì)U251細(xì)胞細(xì)胞周期進(jìn)程有抑制作用，可使細(xì)胞周期被阻滯于G2/M期。同時(shí)，研究表明Ad5F35-IL24組可顯著降低U251細(xì)胞的侵襲和遷移能力。
　　 結(jié)論：Ad5F35-IL24能夠誘導(dǎo)人U251細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)G2/M期阻滯，降低腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力。
　　 第

11、三部分腺病毒介導(dǎo)IL-24基因?qū)251膠質(zhì)瘤細(xì)胞ERK和p38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響
　　 目的：探討外源性IL-24基因?qū)251膠質(zhì)瘤細(xì)胞ERK和p38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響。
　　 方法：IL-24基因轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞24小時(shí)后，應(yīng)用Western blot印跡檢測(cè)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白ERK、p-ERK、p38 MAPK和p-p38 MAPK的表達(dá)水平變化。同時(shí)，應(yīng)用MTT、流式細(xì)胞術(shù)、雙熒光染色觀察

12、ERK、p38 MAP蛋白抑制劑PD98059、SB203580作用后，對(duì)IL-24基因介導(dǎo)U251細(xì)胞殺傷作用的影響，以及細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白表達(dá)水平的變化。
　　 結(jié)果：Western Blot結(jié)果表明：外源性IL-24基因作用于膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251后，p38 MAPK和p-p38 MAPK蛋白表達(dá)（0.46±0.07，0.60±0.07）明顯增強(qiáng)。將p38 MAPK抑制劑SB203580與Ad5F35-IL24合用后（20.83±

13、1.34），較Ad5F35-IL24單用組（36.15±2.61）殺傷作用減弱。ERK和p-ERK蛋白的與對(duì)照組相比沒有顯著改變。ERK蛋白抑制劑PD98059與Ad5F35-IL24合用，能夠提高IL-24基因?qū)251的殺傷作用。
　　 結(jié)論：外源性IL-24基因?qū)251的選擇性誘導(dǎo)凋亡作用，可能與其上調(diào)并激活p38 MAPK表達(dá)有關(guān)。而阻斷ERK途徑可進(jìn)一步提高IL-24基因?qū)δ[瘤細(xì)胞的殺傷。
　　 第四部分腺病

14、毒介導(dǎo)IL-24基因?qū)251膠質(zhì)瘤細(xì)胞拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα、bcl-2及caspase-3表達(dá)的影響
　　 目的：觀察外源性IL-24基因?qū)cl-2、caspase-3以及拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα表達(dá)（TopoⅡα）的影響。
　　 方法：應(yīng)用Western blot印跡、RT-PCR、流式細(xì)胞術(shù)、免疫細(xì)胞化學(xué)的方法檢測(cè)bcl-2、caspase-3和TopoⅡα蛋白的表達(dá)變化情況。
　　 結(jié)果：Western blot印跡結(jié)

15、果表明，Ad5F35-IL24組TopoⅡα蛋白表達(dá)（0.48±0.03，0.31±0.02）較對(duì)照組（1.35±0.07）和空載體VEC組（1.39±0.11，1.26±0.06）表達(dá)減低。且隨IL-24基因表達(dá)濃度增高TopoⅡα表達(dá)隨之減低。Ad5F35-IL24組bcl-2的表達(dá)（0.02±0.01）也較對(duì)照組（0.17±0.02）和空載體VEC組（0.18±0.01）表達(dá)減低。Ad5F35-IL24組caspase-3蛋白的表

16、達(dá)（0.71±0.09）較對(duì)照組（0.43±0.04）和空載體VEC組（0.47±0.02）表達(dá)增加。
　　 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表明，caspase-3表達(dá)增加，bcl-2表達(dá)降低。Western blot印跡、RT-PCR、流式細(xì)胞術(shù)的方法觀察到TopoⅡα表達(dá)降低，且與藥物濃度增加成反比。免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TopoⅡα表達(dá)降低。
　　 結(jié)論：外源性IL-24基因殺傷U251細(xì)胞，TopoⅡα、bcl-2、caspase