沙利度胺對(duì)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251的體外作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、目的：通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)觀察沙利度胺對(duì)人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251增殖及對(duì)缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF和對(duì)鈣離子Ca2+濃度的影響，進(jìn)一步闡明沙利度胺抗腫瘤、抗血管生成和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，同時(shí)觀察沙利度胺聯(lián)合順鉑對(duì)U251細(xì)胞的作用。 方法： 1、選取人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞系進(jìn)行體外培養(yǎng)，采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)沙利度胺不同濃度組(10、25、50、100μg/ml)、不同時(shí)間組(24、4

2、8、72h)對(duì)U251細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的影響情況。流式細(xì)胞儀測(cè)定沙利度胺對(duì)U251細(xì)胞周期分布和凋亡的影響。 2、根據(jù)MTT的結(jié)果，設(shè)置對(duì)照及實(shí)驗(yàn)組，分別提取各組細(xì)胞總RNA，鑒定其完整性及含量，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(revers transcription PCR，RT-PCR)半定量檢測(cè)沙利度胺處理前后U251細(xì)胞中HIF-1和VEGFmRNA的表達(dá)水平。采用流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry，F(xiàn)CM)定量檢測(cè)沙利度胺

3、處理前后U251細(xì)胞周期分布和凋亡及對(duì)HIF-1和VEGF蛋白表達(dá)的影響。 3、采用MTT比色法檢測(cè)沙利度胺與抗癌藥物順鉑聯(lián)合應(yīng)用后對(duì)U251細(xì)胞的增殖抑制作用，測(cè)定其吸光度(OD)值，并采用isobolanalysis公式分析相互作用指數(shù)(Iteraction Index)，評(píng)價(jià)兩藥聯(lián)合后的作用，如相互作用指數(shù)>1為兩藥拮抗作用；相互作用指數(shù)=1為兩藥相加作用；相互作用指數(shù)<1為兩藥協(xié)同作用。 4、利用激光共聚焦顯微鏡

4、觀察沙利度胺不同濃度組(10、25、50、100μg/ml)作用72h后U251細(xì)胞中Ca2+熒光強(qiáng)度的變化。 結(jié)果： 1、MTT結(jié)果顯示：沙利度胺在(10～100)μg/ml濃度范圍內(nèi)能明顯抑制U251細(xì)胞體外增殖，隨著時(shí)間、濃度增加抑制率相應(yīng)升高，以100μg/ml組作用72h抑制率最高。與對(duì)照組相比，不同濃度組對(duì)U251細(xì)胞抑制率差異均具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。沙利度胺處理細(xì)胞48、72h，IC50分別

5、為51.62μg/ml、35.76μg/ml。流式細(xì)胞儀檢測(cè)U251細(xì)胞周期分布和凋亡顯示，10、25、50、100μg/ml沙利度胺作用U251細(xì)胞72h，隨藥物濃度增大，G0/G1期細(xì)胞逐漸增多;S期、G2/M期細(xì)胞則逐漸減少。即沙利度胺可阻滯U251細(xì)胞周期進(jìn)程于G1期，該作用呈劑量-效應(yīng)依賴關(guān)系。10、25、50、100μg/ml沙利度胺處理細(xì)胞72h后，出現(xiàn)典型的亞二倍體凋亡峰，依沙利度胺濃度增大而逐漸升高；凋亡百分率分別為：

6、9.31％、14.53％、19.36％、28.30％，較對(duì)照組有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。 2、半定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：沙利度胺不同濃度組處理U251細(xì)胞72h后，HIF-1和VEGFmRNA都有不同程度的降低。100μg/ml沙利度胺濃度組作用72h對(duì)U251細(xì)胞HIF-1和VEGF mRNA表達(dá)抑制最顯著，比較沙利度胺處理前HIF-1和VEGFmRNA表達(dá)水平差異具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。流式細(xì)胞

7、術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示：0、10、25、50、100μg/ml沙利度胺處理U251細(xì)胞72h后U251細(xì)胞中HIF-1蛋白表達(dá)熒光指數(shù)(FI值)分別為1.719、1.645、1.329、1.202、1.081，VEGF蛋白表達(dá)熒光指數(shù)(FI值)分別為2.248、1.976、1.553、1.337、1.097。比較處理組和對(duì)照組的FI值，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。以100μg/ml、72h對(duì)HIF-1和VEGF抑制最顯著，與RT-PCR

8、結(jié)果一致。 3、MTT比色法分析沙利度胺聯(lián)合順鉑對(duì)U251細(xì)胞的增殖抑制作用，結(jié)果顯示：沙利度胺可加強(qiáng)順鉑對(duì)U251細(xì)胞的增殖抑制作用。在10～100μg/ml范圍內(nèi)，隨沙利度胺濃度的增大，其對(duì)順鉑的協(xié)同作用增強(qiáng)。單用順鉑的IC50為22.31μg/ml，聯(lián)合10、25、50μg/ml沙利度胺后可將順鉑的IC50分別降低至9.62、4.68、2.41μg/mlμg/ml。因此，在一定濃度范圍內(nèi)，沙利度胺可協(xié)同順鉑抑制U251細(xì)胞

9、的生長(zhǎng)增殖。 4、Isobolanalysis分析相互作用指數(shù)顯示，沙利度胺聯(lián)合順鉑在細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為50％時(shí)的相互作用指數(shù)為0.86，證明沙利度胺確實(shí)可協(xié)同順鉑對(duì)U251細(xì)胞的增殖抑制作用。 5、激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)結(jié)果示：沙利度胺在10～100μg/ml濃度范圍內(nèi)能明顯使U251細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，即鈣離子逐漸濃度升高，且隨著沙利度胺濃度增加Ca2+濃度相應(yīng)升高，以100μg/ml組作用72h后細(xì)胞中Ca

10、+熒光強(qiáng)度最高。 結(jié)論： 1、本實(shí)驗(yàn)證實(shí)在一定濃度范圍內(nèi)，沙利度胺能夠抑制U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，并呈濃度一時(shí)間依賴關(guān)系。 2、沙利度胺可阻滯膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251于G1期并可誘導(dǎo)該細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是其抗腫瘤作用機(jī)制之一。 3、一定濃度的沙利度胺能夠在mRNA和蛋白水平抑制U251細(xì)胞中HIF-1和VEGF表達(dá)。 4、沙利度胺可以使U251細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，證明其具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用