Notch1基因?qū)θ四z質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖和周期的影響及其機(jī)制的初步研究.pdf

1、目的：
　　 1、檢測(cè)Notch1基因?qū)θ四z質(zhì)瘤U251增殖和細(xì)胞周期的影響。
　　 2、探討Notch1基因影響人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖和周期的可能機(jī)制。
　　 方法：
　　 1、利用Notch1-shRNA和pNL-NICD/EGFP慢病毒感染人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞，RT-PCR和Western Blotting法篩選和鑒定Notch1表達(dá)下調(diào)或Notch1胞內(nèi)段(Notch1 intracellula

2、r domain，NICD)表達(dá)上調(diào)的U251細(xì)胞。
　　 2、MTT法和PI單染流式細(xì)胞術(shù)分析Notch1對(duì)細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響。
　　 3、采用RT-PCR和Western blotting法檢測(cè)NF-κB p65表達(dá)；EMSA法檢測(cè)NF-κB的活性。
　　 4、采用RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)基因，包括p53，p21，p27，p16，cyclinD1，cyclinE1，cyclinA2，cyclinB

3、1，cyclinB2，CDK2，CDK4，CDK6，Cdc25C的表達(dá)情況，對(duì)mRNA表達(dá)水平變化的基因，進(jìn)一步采用Western blotting法檢測(cè)其蛋白表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：
　　 1、Notch1-shRNA慢病毒表達(dá)載體能有效下調(diào)U251細(xì)胞Notch1的表達(dá)，而pNL-NICD/EGFP慢病毒表達(dá)載體能有效上調(diào)U251細(xì)胞NICD的表達(dá)。
　　 2、Notch1基因表達(dá)下調(diào)的細(xì)胞其細(xì)胞增殖能力受到

4、明顯抑制(P＜0.01)，并引起細(xì)胞G1期阻滯(P＜0.01)，S期細(xì)胞減少(P＜0.01)；在NICD表達(dá)上調(diào)的細(xì)胞其增殖能力明顯增強(qiáng)(P＜0.01)，且引起G1期細(xì)胞減少(P＜0.05)，S期細(xì)胞增加(P＜0.01)。
　　 3、Notch1基因表達(dá)下調(diào)的細(xì)胞其N(xiāo)F-κB p65 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05)，NF-κB DNA結(jié)合活性顯著降低(P＜0.01)；在NICD表達(dá)上調(diào)的細(xì)胞其N(xiāo)F-κB p65m

5、RNA和蛋白表達(dá)水平顯著增加(P＜0.01)，NF-κB DNA結(jié)合活性顯著增加(P＜0.01)。
　　 4、Notch1基因表達(dá)下調(diào)的細(xì)胞其cycl inD1、cyclinA2、CDK2、Cdc25C的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低(P＜0.01)；而在NICD表達(dá)上調(diào)的細(xì)胞，這些基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著增加(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、Notch1基因與人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的增殖能力和周