靶向Neuropilin-單克隆抗體抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251對Fibronectin的粘附作用及其機(jī)制研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　 腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的原發(fā)性腫瘤，大多數(shù)為浸潤性和膨脹性生長，預(yù)后相對較差。據(jù)美國統(tǒng)計的資料顯示，在所有膠質(zhì)細(xì)胞瘤中約占半數(shù)的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者1年生存率約30％，5年生存率不到5％。盡管目前采取最大限度的手術(shù)切除及術(shù)后放療與化療結(jié)合等綜合治療，但是惡性膠質(zhì)瘤(malignant gliomas，MG)的臨床預(yù)后仍不樂觀。目前分子靶向治療已經(jīng)成為近年來腫瘤治療的熱點(diǎn)，但是靶向治療腫瘤的效果仍然十分有限，因此

2、，發(fā)現(xiàn)新的腫瘤治療靶點(diǎn)顯得極為重要。人神經(jīng)菌毛索1(Neuropilin-1，NRP-1)是一種新型的多功能受體，近年來，大量研究結(jié)果顯示NRP-1可表達(dá)于新生血管的內(nèi)皮細(xì)胞和多種腫瘤細(xì)胞，并參與腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等過程。研究表明，NRP-1在膠質(zhì)瘤的各個發(fā)展階段都有較高的表達(dá)，被認(rèn)為是一個很有希望的治療新靶點(diǎn)。本文旨在利用本實(shí)驗室制各的抗NRP-1單克隆抗體針對膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251的粘附抑制作用及其機(jī)制做進(jìn)一步的研究。
　

3、　 實(shí)驗方法:
　　 將雜交瘤細(xì)胞腹腔種植于Balb/c鼠、生產(chǎn)抗NRP-1單克隆抗體腹水，抗體用rProteinA親和柱純化，利用間接ELISA，Westernblot，流式細(xì)胞術(shù)和細(xì)胞免疫熒光染色對生產(chǎn)的單克隆抗體的特異性和親和力進(jìn)行檢測。免疫印跡法(Western blot)及細(xì)胞免疫熒光檢測NRP-1蛋白在膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251的表達(dá)。通過粘附實(shí)驗研究NRP-1單克隆抗體對膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251粘附的影響。通過共聚焦熒光顯

4、微鏡觀察羅丹明-鬼筆環(huán)肽染色后NRP-1單克隆抗體對膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251應(yīng)力纖維的形成的影響。通過免疫共沉淀、westemblot研究NRP-1單克隆抗體對膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251作用后粘附于FN因子上相關(guān)蛋白含量的變化。
　　 實(shí)驗結(jié)果:
　　 結(jié)果顯示，我們制備的抗NRP-1抗體純化后純度高達(dá)95％，濃度為4mg/ml。Western Blot實(shí)驗顯示抗體能特異識別膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中的NRP-1蛋白;細(xì)胞免疫熒光染色顯

5、示NRP-1 MAb定位于膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞膜上。粘附實(shí)驗表明抗NRP-1抗體對膠質(zhì)瘤U251具有粘附抑制的作用。通過共聚焦熒光顯微鏡、免疫共沉淀、western blot實(shí)驗發(fā)現(xiàn)，抗NRP-1抗體可以抑制粘附的膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的應(yīng)力纖維的形成，影響整合素α5β1與NRP-1復(fù)合物的形成，降低FAK、p130cas的磷酸化水平。
　　 結(jié)論:
　　 本實(shí)驗成功制備了高純度和高特異性的NRP-1 MAb;粘附實(shí)驗結(jié)果表明