大蒜素抑制人腦膠質瘤U251細胞株生長及其機制的實驗研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　 膠質瘤是常見的高惡性度的顱內腫瘤，雖經手術、放療及化療等綜合治療后，患者的存活率仍低，大多數(shù)患者從確診時計算，存活時間不到1年?；疾『髮颊吆图彝ピ斐蓸O大的身心痛苦和經濟負擔。目前的治療惡性膠質瘤的藥物很多，但副作用大，加之腫瘤細胞日益產生的耐藥性，影響了藥物的療效，因此，迫切需要尋找并研制出更好的治療藥物。大蒜中所含的抗癌活性成分．大蒜素，作為一種天然來源的二烯丙基三硫化物(DADS)，有希望成為治療膠

2、質瘤的有效藥物。國內外學者經細胞和動物實驗證實，大蒜素對胃癌、肝癌、膀胱癌、白血病等腫瘤細胞及組織有抑制和殺傷作用。但鮮見對大蒜素應用于膠質瘤的報道。
　　 本實驗擬(1)觀察大蒜素對體外培養(yǎng)的人腦膠質瘤U251細胞株的形態(tài)學及細胞周期的影響，探討大蒜素是否對U251細胞株具有增殖抑制作用；(2)觀察大蒜素對U251細胞凋亡的影響；(3)觀察大蒜素作用U251細胞后，bcl-2/bax基因表達的變化，初步探討大蒜素誘導U251細

3、胞凋亡的相關機制。
　　 方法：
　　 1.CCK-8法檢測不同濃度大蒜素作用12、24、48h后對U251細胞增殖的影響。
　　 2.熒光顯微鏡觀察經大蒜素作用24h后的Hoechst33342熒光染色后凋亡細胞形態(tài)。
　　 3.流式細胞儀檢測經AnnexinV-FITC和PI雙染后的細胞凋亡率，并檢測細胞周期的改變。
　　 4.免疫組化法檢測不同濃度大蒜素處理后細胞的bcl-2和bax基因表達

4、的灰度值變化。
　　 結果：
　　 1.用CCK8-法測定并根據(jù)公式計算不同濃度、不同作用時間后的細胞存活率，所得數(shù)據(jù)采用析因設計資料的方差分析，按檢驗水準α=0.05，可知，不同濃度大蒜素與其對U251細胞不同作用時間的交互效應無統(tǒng)計學意義(F=1.659，P=0.128)。故采用無交互效應的兩因素方差分析。由統(tǒng)計結果可知，大蒜素對U251細胞的作用有時間依賴性（F=25.307，P＜0.001）和濃度依賴性(F=80

5、.713，P＜0.001)。隨大蒜素作用濃度的增加、作用時間的延長，U251細胞受抑制作用越明顯。根據(jù)中效方程式，求出大蒜素作用12、24、48h后U251細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為55.1μg/ml、39.5μg/ml、21.6μg/ml。
　　 2.流式細胞儀檢測0、40μg/ml大蒜素作用U251細胞24h后細胞周期G1、S、G2期分別占的百分比，經單因素方差分析，組間比較用t檢驗，得到0pg/ml組G1、S、G

6、2期分別為(54.00±2.01)％、(23.56±1.62)％、(21.26±1.08)％,40μg/ml組G1、S、G2期分別為(67.41±2.14)％、(16.35±2.98)％、(13.90±1.18)％，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。提示大蒜素作用后，U251細胞周期中G1期比例升高，S、G2期比例降低。
　　 3.流式細胞儀檢測濃度為0、20、40μg/ml大蒜素組作用U251細胞后的凋亡率，經單因素方差分析

7、，LSD-t檢驗，0、20、40μg/ml大蒜素組的凋亡率分別為（2.54±0.57）％、(28.34±3.53)％、(46.57±2.97)％，各濃度組間比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。提示大蒜素所致U251細胞凋亡為濃度依賴關系，大蒜素的作用濃度越高，細胞凋亡越明顯。因而大蒜素能誘導細胞凋亡。
　　 4.40μg/ml大蒜素作用U251細胞24h后，經Hoechst33342熒光染色，在熒光顯微鏡下觀察，可見凋亡細

8、胞，細胞體積縮小，細胞核固縮、凝聚，核染色質邊集，出現(xiàn)濃染致密的強藍色顆粒塊熒光信號。
　　 5.免疫組化法經0、20、40μg/ml大蒜素作用24h后，分別測量細胞漿中bcl-2和bax表達的灰度值，經單因素方差分析，LSD-t檢驗，得到bcl-2表達的灰度值分別為84.6±3.3、124.6±3.7、147.5±3.3，bax表達的灰度值分別為154.8±2.8、134.5±4.3、104.5±2.7，各濃度組間比較，有統(tǒng)計

9、學意義(P＜0.001)。隨著大蒜素濃度的增加，bax基因表達的灰度值下降，bcl-2基因表達的灰度值升高。說明bax的基因表達逐漸增強，而bcl-2的基因表達逐漸減弱。提示大蒜素通過下調U251細胞的bcl-2表達，上調bax表達來誘導細胞凋亡。
　　 結論：
　　 1.大蒜素能抑制U251膠質瘤細胞的增殖，抑制作用具有濃度、時間依賴性。
　　 2.大蒜素能誘導U251細胞凋亡，作用強度與其濃度相關。