海參皂苷fuscocinerosideA抑制人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U251細(xì)胞生長實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤是顱內(nèi)最常見的腫瘤，它起源于正常的星形細(xì)胞或其前體祖細(xì)胞；而膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是最兇險(xiǎn)、也是最常見的一種惡性膠質(zhì)瘤，它在腦實(shí)質(zhì)彌漫性浸潤的特性加上對(duì)普通化療藥物的相對(duì)耐藥性以及射線的不敏感性，導(dǎo)致目前包括外科治療在內(nèi)的各種綜合治療效果均不佳，其中位生存期據(jù)文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)只有9～12個(gè)月，迫切需要新的治療方案或新的敏感藥物問世。海參廣泛存在于我國的海洋中，它的主要次生代謝產(chǎn)物三萜皂苷不僅具有抗病毒、抗真菌及抗凝血等活性，而且其抗癌作用也很

2、顯著。FuscocinerosideA系從棕環(huán)海參(holothuria fuscocinerea jaeger)代謝物中新分離出的一種三萜苷，在藥物篩選實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出對(duì)腫瘤細(xì)胞有很強(qiáng)的殺傷作用，但其作用機(jī)制尚未清楚。本文就海參皂苷fuscocinerosideA對(duì)人源性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U251細(xì)胞系增殖的抑制作用進(jìn)行研究，并探討其作用機(jī)制，為fuscocinerosideA作為抗腫瘤新藥的開發(fā)及臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　實(shí)驗(yàn)一，低劑

3、量fuscocinerosideA對(duì)人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U251細(xì)胞的體外生長影響及主要作用機(jī)制
　　四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示fuscocinerosideA對(duì)人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U251細(xì)胞有顯著的生長抑制作用，有明顯的劑量和時(shí)間依賴性；fuscocinerosideA作用U251細(xì)胞48h的IC50及IC75分別為7.8±0.3μM（**P<0.01）和15.4±0.5μM（**P<0.01）；而fuscocinero

4、sideA對(duì)正常膠質(zhì)細(xì)胞毒性作用甚微，僅在本實(shí)驗(yàn)處理的最大劑量32μM經(jīng)過72h，表現(xiàn)出有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的變化，生存率降為82.3％（料P<0.01）；說明在正常膠質(zhì)細(xì)胞能夠耐受的劑量窗內(nèi)即能對(duì)U251膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞有明顯的殺傷作用。
　　與陰性對(duì)照相比，高于4μM的fuscocinerosideA對(duì)U251膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生長抑制更具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（**P<0.01）。本實(shí)驗(yàn)定義<4μMfuscocinerosideA作為實(shí)驗(yàn)的低

5、劑量處理。
　　我們首先探討低劑量fuscocinerosideA對(duì)人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U251細(xì)胞生長抑制的影響。與陰性對(duì)照組相比，2μMfuscocinerosideA對(duì)U251細(xì)胞的生長抑制無明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；用4μMfuscocinerosideA處理U251細(xì)胞，分別經(jīng)過24h、48h及72h的作用，存活率分別降為80.3％、75.5％及71.1％（*P<0.05）；鏡下觀察其形態(tài)學(xué)變化表現(xiàn)為細(xì)胞生長停滯，分

6、裂期細(xì)胞消失；為進(jìn)一步探討低劑量fuscocinerosideA對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞生長抑制的作用機(jī)制，我們用O、2μM及4μM的fuscocinerosideA分別處理U251細(xì)胞24h，并檢測(cè)其細(xì)胞周期的變化。結(jié)果表明，處理組U251細(xì)胞的Go/Gi期細(xì)胞百分比含量明顯增加，并隨處理濃度增大而增加，而S期和G2/M期細(xì)胞百分比含量減少，提示低劑量fuscocinerosideA能夠引起U251細(xì)胞發(fā)生Gi期阻滯；在實(shí)驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)有“亞G

7、i峰”出現(xiàn)，表明未有顯著的凋亡發(fā)生，這進(jìn)一步通過DNA瓊脂糖凝膠電泳得到證實(shí)。Westernblot結(jié)果顯示，未處理的U251膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中p53、p27kip-l和p21waf－1蛋白表達(dá)含量較少，這與U251細(xì)胞的高度惡性腫瘤特性具有一致性；而經(jīng)4μM的fuscocinerosideA處理后的U251細(xì)胞中的p53、p27kip-l和p21waf－1蛋白表達(dá)都有明顯的增多，且伴有時(shí)間依賴性。上述結(jié)果說明低劑量fuscociner

8、osideA誘導(dǎo)的人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U251細(xì)胞Gi期阻滯與p27kip-l的上調(diào)以及p53介導(dǎo)的p2waf-1的表達(dá)升高有關(guān)。
　　實(shí)驗(yàn)二,高劑量fuscocinerosideA對(duì)人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U251細(xì)胞的體外生長影響及主要作用機(jī)制
　　用7.8μM或更大劑量的fuscocinerosideA對(duì)U251膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞處理，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期顯示不但有明顯的Go/Gi期阻滯，并且有典型的細(xì)胞凋亡特征一“亞Gi峰”的出

9、現(xiàn)；提示fuscocinerosideA對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用存在多條細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑。用7.8μMfuscocinerosideA作用U251人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞12h，即可在光鏡下觀察到部分細(xì)胞形態(tài)開始變化，出現(xiàn)貼壁細(xì)胞離壁、變圓等改變；而經(jīng)過作用24h或者更長時(shí)間，HE染色觀察到細(xì)胞皺縮，體積變小，胞漿明顯減少，胞核凝集濃染；Hoechst33342熒光染色觀察到染色質(zhì)凝聚，有典型的核固縮和核碎裂；透射電鏡觀察到細(xì)胞微絨毛消失，溶

10、酶體增多，染色質(zhì)濃集，邊集于胞膜下，呈團(tuán)塊狀分布并有凋亡小體出現(xiàn)；末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的生物素脫氧尿嘧啶核苷酸缺口末端標(biāo)記(TUNEL)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)胞核在熒光顯微鏡下激發(fā)出黃綠色熒光，并有核碎裂、核固縮及凋亡小體出現(xiàn)；DNA瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)凋亡細(xì)胞特征性的“梯狀”條帶；Westernblot結(jié)果顯示survivin在U251人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中高表達(dá)，同樣，這與U251細(xì)胞的腫瘤特性相符；而經(jīng)高劑量fuscocinerosideA處

11、理后survivin蛋白表達(dá)顯著降低；我們還發(fā)現(xiàn)高劑量fuscocinerosideA較低劑量的fuscocinerosideA更能顯著提高p53、p27kip-1和p21waf1蛋白的表達(dá)；同時(shí)caspase-3也被激活，裂解成19kD的活性片段，后者執(zhí)行最后的凋亡過程。說明高劑量fuscocinerosideA誘導(dǎo)的U251人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡與p53的表達(dá)升高以及survivin的下調(diào)有關(guān)，二者可能與caspase-3的激活有

12、聯(lián)系。
　　結(jié)論：海參皂苷fuscocinerosideA能顯著地抑制人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U251細(xì)胞的增殖：在較低劑量作用下，主要為抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，阻滯細(xì)胞周期進(jìn)展在Gi期；而在較高濃度下，fuscocinerosideA不但能誘導(dǎo)Gi/S細(xì)胞周期阻滯，還能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的大量凋亡，并且對(duì)正常膠質(zhì)細(xì)胞的毒性甚微。FuscocinerosideA誘導(dǎo)的Gi/S期阻滯與p27kip-l的上調(diào)以及p53介導(dǎo)的p2lwa-的表達(dá)升高有關(guān)，