阻斷STAT3信號通路對人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖抑制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景： 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(Glioblastoma Multiforme，GBM)是成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，占惡性膠質(zhì)瘤的80％，它是膠質(zhì)瘤惡性度最高的類型。目前膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的主要治療手段是手術(shù)治療，術(shù)后輔以放射治療和化學(xué)藥物治療。雖然在具體方法上有了不少改進(jìn)，但總體療效并沒有獲得明顯的改善，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的平均生存率仍然不足1年。另外，腫瘤的復(fù)發(fā)是膠質(zhì)瘤面臨的最大的問題。所以，需要更加有效治療的手段來改變膠質(zhì)瘤治

2、療的現(xiàn)狀。 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(Signal Fransducers and Activators of Transcription，STAT)是細(xì)胞因子/生長因子信號傳導(dǎo)中重要的胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子，特別是STAT3在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、生存、分化和凋亡中發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，STAT3在包括膠質(zhì)母細(xì)胞瘤在內(nèi)多種惡性腫瘤中表現(xiàn)為持續(xù)酪氨酸磷酸化的活性狀態(tài)。 STAT3的過度活化使下游靶基因表達(dá)失調(diào)，從而使細(xì)胞生長失控，抑制腫

3、瘤細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)腫瘤血管生成，參與腫瘤免疫逃逸，抑制免疫功能，最終導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。因此，STAT3可成為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤治療的具有吸引力的潛在靶點(diǎn)。 目前有多種用于阻斷STAT3的方法，其中包括反義核苷酸、核苷酸酶、異位表達(dá)顯性失活突變體、RNA干擾技術(shù)、抑制上游激酶、磷酸酪氨?？s氨酸和誘騙寡核苷酸等。從葫蘆科和十字科植物中提取的天然三萜類化合物JSI-124，是一種選擇性JAK/STAT3抑制劑，即

4、不抑制其他信號分子，如ERK或JNK。 JSI-124具有很好穿透細(xì)胞膜和酪氨酸激酶抑制的功能。研究已證明，JSI-124能夠非常直接、有效的抑制STAT3磷酸化水平，阻斷JAK/STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而調(diào)控轉(zhuǎn)錄、改變下游靶基因的異常表達(dá)，抑制腫瘤惡性增殖。已有報(bào)道，JSI-124在體內(nèi)外治療人肺腺癌細(xì)胞A549和乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中顯示出極好的療效，這提示了JSI-124在惡性腦膠質(zhì)瘤基因治療中的應(yīng)用潛力。本課題旨

5、在研究應(yīng)用JSI-124靶向性阻斷STAT3信號通路，抑制人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖的效應(yīng)和機(jī)制。研究內(nèi)容分為兩個(gè)部分。 一、阻斷STAT3磷酸化對人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞體外增殖抑制目的檢測人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織標(biāo)本與細(xì)胞中STAT3及其磷酸化活化蛋白的表達(dá)情況，研究人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中STAT3的異常表達(dá)及持續(xù)活化的意義及應(yīng)用JSI-124靶向性阻斷STAT3信號通路對人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)。 方法： 1、

6、臨床收集9例原發(fā)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(WHOⅣ級)和3例正常腦標(biāo)本組織。 Western blot方法檢測組織標(biāo)本和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系A(chǔ)172與U251的STAT3總蛋白和705位磷酸化活化蛋白表達(dá)水平，并對其異常表達(dá)及持續(xù)活化的情況進(jìn)行分析。 2、不同濃度JSI-124作用A172和U25l細(xì)胞24、48及72小時(shí)后，用CCK-8法檢測腫瘤細(xì)胞STAT3號通路阻斷前后細(xì)胞增殖的改變，檢測450 nm、630nm雙波長各孔吸光度

7、值OD450-630。以每個(gè)時(shí)間點(diǎn)空白對照組吸光值作為1并計(jì)算各組相對生長率。相對生長率=各組OD450-630/空白對照組OD450-630。 3、不同濃度的JSI-124處理人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U251和A172細(xì)胞24小時(shí)后顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變。 4、Western blot方法檢測人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤A172、U251細(xì)胞在JSI-124不同濃度和不同時(shí)間作用下STAT3和p-STAT3(Tyr705)蛋白的表達(dá)情況。

8、 結(jié)論 1、人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織和細(xì)胞系中STAT3的過高表達(dá)及持續(xù)活化具有普遍意義，說明STAT3信號傳導(dǎo)通路在人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)生、發(fā)展具有重要作用，可作為人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤一個(gè)有效和潛在的治療靶點(diǎn)。 2、U251和A172細(xì)胞中存在STAT3和磷酸化STAT3的異常表達(dá)，可以作為本課題的研究對象。 3、JSI-124具有高效透膜特性，能夠直接、有效抑制STAT3磷酸化，靶向性阻斷STAT3信號通路。但

9、是，這是一相對緩慢的過程。 4、JSI-124能夠安全有效地抑制人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖。 二、JSI-124阻斷STAT3信號通路對腫瘤細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期的影響及機(jī)制研究 目的： 檢測JSI-124對人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞周期和凋亡的影響，并分析凋亡和細(xì)胞周期相關(guān)基因變化，進(jìn)而深入探討JSI-124靶向性阻斷STAT3信號通路抑制人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖的相關(guān)機(jī)制。 方法： 1、用流式細(xì)胞

10、儀檢測JSI-124處理36小時(shí)后的A172、U251細(xì)胞分別在O、100、200nM和0、50、100 nM的細(xì)胞凋亡率。傳統(tǒng)的PCR擴(kuò)增β-actm分析所提RNA質(zhì)量；JSI-124作用A172、L]251細(xì)胞24小時(shí)后，Real-time PCR檢測STAT3下游相關(guān)靶基因Bcl-xl和Survivin的mRNA相對表達(dá)水平的影響。 2、用流式細(xì)胞儀檢測JSI-124處理A172和U251細(xì)胞及對照組NIH3T3細(xì)胞36小

11、時(shí)后的細(xì)胞周期情況。在基因水平采用Real-time PCR檢測細(xì)胞周期調(diào)控基因cdc2和cyclin B1變化，同時(shí)Western blot方法分析JSI-124對cde2和cyclinB1基因蛋白表達(dá)水平的影響。 結(jié)論： 1、JSI-124能夠通過下調(diào)凋亡相關(guān)基因誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡。 2、JSI-124能夠通過下調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)基因阻滯膠質(zhì)瘤母細(xì)胞瘤細(xì)胞從G2期向M期轉(zhuǎn)換。 總之，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中