阻斷STAT3信號通路對IL-6誘導胰腺癌細胞EMT的影響及機制研究.pdf

1、目的:
　　 應用白細胞介素6(interleukin-6,IL-6)誘導胰腺癌細胞株信號傳導和轉錄激活因子3(signal transduction and activators of transcription-3,STAT3)活化,并檢測STAT3下游基因的表達及侵襲能力的改變,構建RNA干擾(RNA interference,RNAi)慢病毒載體,轉染人胰腺癌細胞株,建立STAT3基因沉默的胰腺癌細胞株,檢測與上皮間質轉

2、換(epithelial tomesenchymal transition,EMT)相關基因的表達及侵襲能力的改變,探討STAT3信號通路在胰腺癌上皮間質轉換中的作用機制,以及阻斷STAT3信號通路對IL-6誘導人胰腺癌細胞株EMT的抑制作用。
　　 方法：
　　 1.應用IL-6刺激人胰腺癌細胞株Capan-2和SW1990誘導STAT3蛋白的磷酸化。MTT檢測細胞的增殖情況；使用免疫細胞化學技術、實時定量PCR、We

3、stern blot方法檢測IL-6對人胰腺癌細胞株STAT3、磷酸化STAT3(phosphorylated STAT3,P-STAT3)、基質金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)、血管內皮生長因子(vascularendothelial growth factor,WGF)的mRNA、蛋白含量的變化。細胞侵襲測定試劑盒檢測人胰腺癌細胞株SW1990和Capan-2的體外侵襲力的改變。

4、r>　　 2.構建針對STAT3基因shRNA重組慢病毒載體。建立穩(wěn)定沉默STAT3基因的胰腺癌細胞株SW1990,檢測細胞增殖和細胞周期的變化；觀察STAT3 siRNA表達載體對SW1990細胞中STAT3的抑制作用；檢測SW1990細胞STAT3基因沉默前后侵襲力的變化和EMT相關基因mRNA和蛋白表達的改變。
　　 3.IL-6刺激應用Janus激酶(Janus kinase,JAK)抑制劑AG490和沉默STAT3基

5、因的SW1990細胞株,檢測應用IL-6前后STAT3、PSTAT3、Twist、Snail和E.cadherin的mRNA、蛋白含量；體外細胞侵襲實驗觀察侵襲能力的改變。
　　 結果：
　　 1.SW1990細胞株中P-STAT3蛋白呈高表達,而Capan-2細胞株中呈低表達；應用含IL-6培養(yǎng)液培養(yǎng)胰腺癌SW1990及Capan-2細胞株48h后,細胞增殖明顯增強(P<0.05)；P-STAT3的表達增強(P<0.0

6、5)；VEGF和MMP-2的mRNA和蛋白表達也明顯升高(P<0.05)；SW1990細胞體外侵襲能力比Capan-2細胞強；IL-6作用24h后兩株細胞株體外侵襲能力明顯增強。
　　 2.成功構建STAT3 siRNA慢病毒表達載體,轉染293T細胞,轉染效率約為60-70％。逐孔稀釋滴度法測定病毒滴度為1x109TU/ml。慢病毒STAT3siRNA載體轉染SW1990細胞株,通過觀察細胞中綠色熒光蛋白表達,轉染效率大于90

7、％。獲得穩(wěn)定轉染的SW1990細胞株的STAT3mRNA和蛋白的表達水平比未轉染組分別下降了78％和80％。STAT3基因沉默SW1990細胞后,其Snail mRNA和蛋白表達明顯下調(P<0.05),E-cadherin明顯上調(P<0.05)。而Twist基因呈低表達,STAT3沉默后對Twist基因的表達無明顯影響。
　　 3.IL-6刺激應用AG490和沉默STAT3基因的SW1990細胞株。在AG490組,Snail

8、基因表達明顯升高(P<0.05),E-cadherin基因表達明顯下降(P<0.05)。在沉默STAT3基因組,Snail基因表達有所升高,但無統計學差異(P>0.05)。E-cadherin基因表達明顯升高(P<0.05)。體外侵襲實驗表明IL-6刺激應用AG490和沉默STAT3基因的SW1990細胞株,侵襲能力較對照組細胞明顯增強(P<0.05)。
　　 結論：
　　 1.IL-6可誘導胰腺癌細胞株STAT3蛋白的

9、磷酸化,上調MMP-2和VEGF表達,促進胰腺癌細胞增殖和增強胰腺癌細胞的侵襲能力。IL-6可能通過STAT3信號通路在胰腺癌侵襲轉移中起著重要作用。
　　 2.本研究成功構建慢病毒STAT3 siRNA表達載體,建立了STAT3基因穩(wěn)定沉默的胰腺癌細胞系。能有效抑制SW1990細胞株中STAT3表達。通過下調Snail和上調E-cadherin的表達,抑制人胰腺癌細胞上皮間質轉換。為研究STAT3在胰腺癌中的作用機制提供了研究