阻斷STAT3信號(hào)通路對(duì)IL-6誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞EMT的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　 應(yīng)用白細(xì)胞介素6(interleukin-6,IL-6)誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞株信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transduction and activators of transcription-3,STAT3)活化,并檢測STAT3下游基因的表達(dá)及侵襲能力的改變,構(gòu)建RNA干擾(RNA interference,RNAi)慢病毒載體,轉(zhuǎn)染人胰腺癌細(xì)胞株,建立STAT3基因沉默的胰腺癌細(xì)胞株,檢測與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)

2、換(epithelial tomesenchymal transition,EMT)相關(guān)基因的表達(dá)及侵襲能力的改變,探討STAT3信號(hào)通路在胰腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換中的作用機(jī)制,以及阻斷STAT3信號(hào)通路對(duì)IL-6誘導(dǎo)人胰腺癌細(xì)胞株EMT的抑制作用。
　　 方法：
　　 1.應(yīng)用IL-6刺激人胰腺癌細(xì)胞株Capan-2和SW1990誘導(dǎo)STAT3蛋白的磷酸化。MTT檢測細(xì)胞的增殖情況；使用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)、實(shí)時(shí)定量PCR、We

3、stern blot方法檢測IL-6對(duì)人胰腺癌細(xì)胞株STAT3、磷酸化STAT3(phosphorylated STAT3,P-STAT3)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)、血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelial growth factor,WGF)的mRNA、蛋白含量的變化。細(xì)胞侵襲測定試劑盒檢測人胰腺癌細(xì)胞株SW1990和Capan-2的體外侵襲力的改變。

4、r>　　 2.構(gòu)建針對(duì)STAT3基因shRNA重組慢病毒載體。建立穩(wěn)定沉默STAT3基因的胰腺癌細(xì)胞株SW1990,檢測細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的變化；觀察STAT3 siRNA表達(dá)載體對(duì)SW1990細(xì)胞中STAT3的抑制作用；檢測SW1990細(xì)胞STAT3基因沉默前后侵襲力的變化和EMT相關(guān)基因mRNA和蛋白表達(dá)的改變。
　　 3.IL-6刺激應(yīng)用Janus激酶(Janus kinase,JAK)抑制劑AG490和沉默STAT3基

5、因的SW1990細(xì)胞株,檢測應(yīng)用IL-6前后STAT3、PSTAT3、Twist、Snail和E.cadherin的mRNA、蛋白含量；體外細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)觀察侵襲能力的改變。
　　 結(jié)果：
　　 1.SW1990細(xì)胞株中P-STAT3蛋白呈高表達(dá),而Capan-2細(xì)胞株中呈低表達(dá)；應(yīng)用含IL-6培養(yǎng)液培養(yǎng)胰腺癌SW1990及Capan-2細(xì)胞株48h后,細(xì)胞增殖明顯增強(qiáng)(P<0.05)；P-STAT3的表達(dá)增強(qiáng)(P<0.0

6、5)；VEGF和MMP-2的mRNA和蛋白表達(dá)也明顯升高(P<0.05)；SW1990細(xì)胞體外侵襲能力比Capan-2細(xì)胞強(qiáng)；IL-6作用24h后兩株細(xì)胞株體外侵襲能力明顯增強(qiáng)。
　　 2.成功構(gòu)建STAT3 siRNA慢病毒表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,轉(zhuǎn)染效率約為60-70％。逐孔稀釋滴度法測定病毒滴度為1x109TU/ml。慢病毒STAT3siRNA載體轉(zhuǎn)染SW1990細(xì)胞株,通過觀察細(xì)胞中綠色熒光蛋白表達(dá),轉(zhuǎn)染效率大于90

7、％。獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的SW1990細(xì)胞株的STAT3mRNA和蛋白的表達(dá)水平比未轉(zhuǎn)染組分別下降了78％和80％。STAT3基因沉默SW1990細(xì)胞后,其Snail mRNA和蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05),E-cadherin明顯上調(diào)(P<0.05)。而Twist基因呈低表達(dá),STAT3沉默后對(duì)Twist基因的表達(dá)無明顯影響。
　　 3.IL-6刺激應(yīng)用AG490和沉默STAT3基因的SW1990細(xì)胞株。在AG490組,Snail

8、基因表達(dá)明顯升高(P<0.05),E-cadherin基因表達(dá)明顯下降(P<0.05)。在沉默STAT3基因組,Snail基因表達(dá)有所升高,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。E-cadherin基因表達(dá)明顯升高(P<0.05)。體外侵襲實(shí)驗(yàn)表明IL-6刺激應(yīng)用AG490和沉默STAT3基因的SW1990細(xì)胞株,侵襲能力較對(duì)照組細(xì)胞明顯增強(qiáng)(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.IL-6可誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞株STAT3蛋白的

9、磷酸化,上調(diào)MMP-2和VEGF表達(dá),促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖和增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞的侵襲能力。IL-6可能通過STAT3信號(hào)通路在胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中起著重要作用。
　　 2.本研究成功構(gòu)建慢病毒STAT3 siRNA表達(dá)載體,建立了STAT3基因穩(wěn)定沉默的胰腺癌細(xì)胞系。能有效抑制SW1990細(xì)胞株中STAT3表達(dá)。通過下調(diào)Snail和上調(diào)E-cadherin的表達(dá),抑制人胰腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換。為研究STAT3在胰腺癌中的作用機(jī)制提供了研究