吉西他濱對胰腺癌細胞干性的影響及機制研究.pdf

1、本文分為以下幾個部分:
　　第一部分:吉西他濱處理增強胰腺癌細胞的干性特征
　　目的：研究吉西他濱處理對胰腺癌細胞系SW1990、BxPC-3的干性能力及相關生物學特征的影響
　　方法：通過MTT實驗檢測不同濃度的吉西他濱處理對胰腺癌細胞系SW1990、BxPC-3的殺傷能力；選擇較低的不同濃度吉西他濱（1-10μM）處理SW1990、BxPC-3細胞系，通過流式細胞術檢測干細胞標志分子CD24及CD133的表達情況；

2、利用RT-PCR檢測不同濃度吉西他濱處理后對干性分子Bmi1、Nanog和Sox2的mRNA水平表達影響；通過Western-Blot方法檢測不同濃度吉西他濱處理后對上述干性分子的蛋白水平表達的變化；進一步通過干細胞成球實驗檢測吉西他濱處理后對胰腺癌細胞系的成球能力的影響；然后再利用吉西他濱（10μM）處理胰腺癌細胞系SW1990、BxPC-324h，通過Transwell遷移實驗檢測對遷移能力的影響；通過MTT實驗檢測處理后對吉西他濱

3、及5-氟尿嘧啶的藥物敏感性改變。
　　結果：不同濃度吉西他濱（0-1000μM）處理胰腺癌細胞系SW1990、BxPC-324h后，隨著濃度增加，對胰腺癌細胞的殺傷能力也增加，但在較低濃度范圍內（0-10μM）對SW1990、BxPC-3的殺傷能力較小。1-10μM吉西他濱處理SW1990、BxPC-3細胞系24h后，干細胞表面標記CD24+和CD133+的細胞數(shù)隨著濃度增加而增加；而且干性分子Bmi1、Nanog和Sox2在mR

4、NA和蛋白水平的表達也隨著吉西他濱處理濃度的增加而增加。吉西他濱（10μM）處理SW1990、BxPC-324h后，細胞的成球能力和遷移能力增強；同時也提高對化療藥吉西他濱及5-氟尿嘧啶的耐藥能力。
　　結論：低劑量的吉西他濱處理可以促進胰腺癌細胞系的干細胞標志分子CD24、CD133以及干性分子Bmi1、Nanog和Sox2的表達，同時也增強胰腺癌細胞系的成球、遷移能力和化療耐藥性。
　　第二部分:STAT3的活化介導吉西

5、他濱誘導胰腺癌細胞的干性增強
　　目的：研究吉西他濱處理對STAT3活化的影響，并探討STAT3的活化對吉西他濱促進胰腺癌細胞干性、遷移、耐藥和體內成瘤能力所起的作用
　　方法：不同濃度吉西他濱（1-10μM）處理24h，利用Western-Blot方法檢測胰腺癌細胞系SW1990、BxPC-3的STAT3的活化情況；通過S3I-201預處理來抑制STAT3活性，然后再聯(lián)合吉西他濱處理，利用流式細胞術檢測干細胞標志分子CD2

6、4及CD133的表達情況；通過RT-PCR檢測干性分子Bmi1、Nanog和Sox2在mRNA水平的表達變化；并利用Western-Blot檢測上述分子在蛋白水平的表達變化；通過干細胞成球實驗檢測聯(lián)合吉西他濱和S3I-201對細胞成球能力的改變；然后利用Transwell遷移實驗檢測對遷移能力的影響；以及通過MTT實驗檢測處理后對吉西他濱及5-氟尿嘧啶的藥物敏感性變化。通過轉染STAT3siRNA，然后再聯(lián)合吉西他濱處理，利用RT-PC

7、R及Western-Blot檢測沉默STAT3對吉西他濱誘導的干性分子Bmi1、Nanog和Sox2表達的影響。吉西他濱（10μM）處理SW1990細胞系后，利用p-STAT3進行免疫共沉淀，通過ChIP的方法檢測其與干性分子Bmi1、Nanog和Sox2啟動子區(qū)域的結合。再通過裸鼠皮下成瘤，聯(lián)合吉西他濱（20mg/kg，q.3d.）以及S3I-201（5mg/kg，q.2d.）腹腔注射，觀察對裸鼠成瘤大小及吉西他濱停藥后腫瘤復發(fā)的影響

8、。
　　結果：吉西他濱可以劑量依賴型的促進p-STAT3（Y705）的表達，利用S3I-201抑制STAT3后，可以減少吉西他濱誘導的干細胞標記分子CD24及CD133和干性分子Bmi1、Nanog和Sox2的表達，而且S3I-201可以抑制吉西他濱所促進的成球、遷移能力以及對吉西他濱、5-氟尿嘧啶耐藥性的增強。沉默STAT3可以顯著抑制吉西他濱誘導的干性分子Bmi1、Nanog和Sox2的表達，而吉西他濱處理則可以增加活化的ST

9、AT3結合到上述三個干性分子啟動子上。此外，S3I-201體內也可以加強吉西他濱的化療殺傷作用，并抑制腫瘤的復發(fā)。
　　結論：吉西他濱通過促進胰腺癌細胞STAT3的活化來介導腫瘤的干性增強，以及與之相關的遷移、耐藥、體內成瘤能力增強。
　　第三部分:Nox/ROS/NF-κB途徑的激活介導吉西他濱誘導胰腺癌細胞的干性增強
　　目的：研究吉西他濱處理對ROS生成及NF-κB信號通路的影響，以及ROS和NF-κB途徑在吉西

10、他濱促進STAT3的活化及干性增強過程中所起的作用，并探討ROS的Nox生成途徑在吉西他濱誘導干性過程中所起的作用。
　　方法：利用DCF-DA探針，通過流式細胞術檢測不同吉西他濱處理對ROS生成的影響；用ROS清除劑（NAC）預處理抑制ROS的生成，然后聯(lián)合吉西他濱處理，利用流式細胞術檢測干細胞標志分子CD24及CD133的表達情況；通過Western-Blot檢測p-STAT3、STAT3及干性分子Bmi1、Nanog和Sox

11、2的表達變化；用干細胞成球實驗觀察NAC對吉西他濱誘導成球能力的影響。吉西他濱（10μM）處理SW1990及BxPC-3細胞系后，通過RT-PCR檢測不同Noxs的表達水平。然后利用Nox抑制劑（Apocynin）預處理，分別利用上述方法檢測CD24、CD133以及p-STAT3、STAT3、Bmi1、Nanog、Sox2的表達變化，同時利用成球實驗檢測Apocynin對成球能力的影響。然后通過核漿分離方法，利用Western-Blot

12、分別檢測吉西他濱及聯(lián)合NAC對核蛋白和漿蛋白中p65含量的表達影響；用NF-κB途徑的抑制劑（BYA11-7082）預處理，再聯(lián)合吉西他濱處理，分別通過流式細胞術、Western-Blot檢測干細胞標志分子CD24及CD133以及p-STAT3、STAT3、Bmi1、Nanog和Sox2的表達情況；再利用干細胞成球實驗觀察BYA11-7082對吉西他濱誘導成球能力的影響。
　　結果：吉西他濱可以促進ROS及Noxs（Nox1,No

13、x2,Nox4,Nox5及Duox1）的生成；抑制ROS或Noxs可以減少吉西他濱誘導的CD24、CD133以及p-STAT3、Bmi1、Nanog和Sox2的表達，同時也可以抑制吉西他濱所誘導成球能力增強。吉西他濱處理可以增加胰腺癌細胞核蛋白p65的表達，同時減少漿蛋白中p65的表達，而聯(lián)合NAC可以抑制上述效應；用BYA11-7082抑制NF-κB的活化后，吉西他濱誘導的CD24、CD133以及p-STAT3、Bmi1、Nanog和