MICA在NK細(xì)胞殺傷胰腺癌中的作用以及吉西他濱對(duì)胰腺癌細(xì)胞MICA蛋白脫落的影響.pdf

1、本研究分為三部分：
　　 第一部分、MICA及NK細(xì)胞活化性受體NKG2D在胰腺癌表達(dá)和臨床意義
　　 目的：
　　 探討MICA及NK細(xì)胞活化性受體NKG2D在胰腺癌表達(dá)和臨床意義。
　　 方法：
　　 RT-PCR技術(shù)檢測(cè)10例胰腺癌、6例慢性胰腺炎和6例正常胰腺組織中MICA mRNA水平。免疫組化技術(shù)檢測(cè)64例胰腺癌、13例慢性胰腺炎和11例正常胰腺組織中MICA的表達(dá)。ELISA和流式細(xì)

2、胞術(shù)分別檢測(cè)53例胰腺癌，7例慢性胰腺炎和20例健康志愿者血清中可溶性MICA(sMICA)水平和外周血中NK細(xì)胞受體NKG2D的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.胰腺癌組織MICA mRNA表達(dá)水平顯著高于慢性胰腺炎和正常胰腺組織(P＜0.01)。
　　 2.免疫組化顯示胰腺癌組織中MICA陽性表達(dá)率為89.1％，顯著高于慢性胰腺炎和正常胰腺組織(P＜0.01)。MICA表達(dá)強(qiáng)度與胰腺癌分化程度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和臨床分

3、期密切相關(guān)(P＝0.042,0.028,0.003)；MICA高表達(dá)的胰腺癌患者預(yù)后較好(P＝0.019)。
　　 3.胰腺癌患者血清sMICA水平顯著高于健康志愿者和慢性胰腺炎患者(P＜0.01)，Ⅲ/Ⅳ期胰腺癌患者血清sMICA水平高于Ⅰ/Ⅱ期患者(P＜0.01)，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的胰腺癌患者血清sMICA水平較無轉(zhuǎn)移患者明顯增高(P＜0.01)。
　　 4.sMICA陽性胰腺癌患者外周血中NK細(xì)胞受體NKG2D的表達(dá)強(qiáng)度

4、明顯低于健康志愿者、慢性胰腺炎患者和sMICA陰性胰腺癌患者(P＜0.01)。胰腺癌患者外周血中NK細(xì)胞受體NKG2D表達(dá)強(qiáng)度與血清sMICA水平呈顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.01)。
　　 5.胰腺癌根治性切除可以下調(diào)患者血清sMICA水平和上調(diào)NK細(xì)胞受體NKG2D的表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 MICA作為免疫監(jiān)視分子在早期胰腺癌組織中廣泛表達(dá)，隨著胰腺癌進(jìn)展，MICA從胰腺癌細(xì)胞表面脫落形成sMICA，血清中sMI

5、CA含量增高可能導(dǎo)致了NK細(xì)胞受體NKG2D表達(dá)的下調(diào)。胰腺癌根治性切除可以下調(diào)患者血清sMICA水平和上調(diào)NK細(xì)胞受體NKG2D的表達(dá)。
　　 第二部分、MICA在NK細(xì)胞殺傷人胰腺癌PANC-1細(xì)胞中的作用
　　 目的：
　　 探討MICA在NK細(xì)胞殺傷人胰腺癌PANC-1細(xì)胞中的作用。
　　 方法：
　　 應(yīng)用NK細(xì)胞分選試劑盒從外周血中負(fù)向分選高純度NK細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。體外培養(yǎng)人胰腺癌PAN

6、C-1細(xì)胞和人NK細(xì)胞，應(yīng)用抗體封閉法，觀察NKG2D與膜型MICA識(shí)別在NK細(xì)胞殺傷PANC-1細(xì)胞中的作用。將正常NK細(xì)胞在含有sMICA陽性胰腺癌患者血清的培基中培養(yǎng)，觀察NK細(xì)胞受體NKG2D的表達(dá)以及NK細(xì)胞對(duì)PANC-1細(xì)胞的殺傷作用。
　　 結(jié)果：
　　 1.經(jīng)MICA或NKG2D抗體封閉后，NK細(xì)胞的殺瘤活性較封閉前顯著減弱(P＜0.01)。
　　 2.胰腺癌患者血清中的sMICA可以下調(diào)NK細(xì)胞

7、受體NKG2D的表達(dá)，并降低NK細(xì)胞對(duì)PANC-1細(xì)胞的殺傷活性。
　　 結(jié)論：
　　 NKG2D與膜型MICA識(shí)別在NK細(xì)胞殺傷人胰腺癌PANC-1細(xì)胞中起重要作用。sMICA是造成胰腺癌免疫逃逸的重要分子機(jī)制之一。
　　 第三部分、ADAM10在人胰腺癌PANC-1細(xì)胞MICA蛋白脫落過程中的作用以及吉西他濱對(duì)MICA蛋白脫落的影響
　　 目的：
　　 探討ADAM10在PANC-1細(xì)胞MIC

8、A蛋白脫落過程中的作用，觀察吉西他濱對(duì)MICA蛋白脫落的影響并探討可能的作用機(jī)制。
　　 方法：
　　 免疫組化檢測(cè)64例胰腺癌和11例正常胰腺組織ADAM10的表達(dá)情況。通過化學(xué)合成的小分子干擾RNA(siRNA)下調(diào)PANC-1細(xì)胞ADAM10表達(dá)后，流式細(xì)胞術(shù)和ELISA分別檢測(cè)細(xì)胞表面MICA的表達(dá)強(qiáng)度和細(xì)胞上清中sMICA的含量。采用MTT法檢測(cè)不同濃度吉西他濱對(duì)PANC-1細(xì)胞增殖的影響。選擇濃度為5ng/m

9、l的吉西他濱作用PANC-1細(xì)胞24小時(shí)，RT-PCR和Western blot檢測(cè)細(xì)胞中ADAM10 mRNA和蛋白表達(dá)水平，同時(shí)用RT-PCR、流式細(xì)胞術(shù)和ELISA分別檢測(cè)MICA mRNA、細(xì)胞表面MICA的表達(dá)強(qiáng)度和細(xì)胞上清中sMICA的含量。先用ADAM10 siRNA或陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染PANC-1細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，再加入吉西他濱（對(duì)照組加等體積培基）繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，流式細(xì)胞術(shù)和ELISA分別檢測(cè)細(xì)胞表面MICA

10、的表達(dá)強(qiáng)度和細(xì)胞上清中sMICA的含量。
　　 結(jié)果：
　　 1.ADAM10在胰腺癌組織中陽性表達(dá)率(87.5％)顯著高于正常胰腺組織(P＜0.01)。
　　 2.下調(diào)ADAM10表達(dá)后，PANC-1細(xì)胞表面MICA表達(dá)增強(qiáng)，而細(xì)胞上清液中sMICA的含量減少(P＜0.01)。
　　 3.當(dāng)培基中濃度小于7ng/ml時(shí)，吉西他濱在24小時(shí)內(nèi)對(duì)PANC-1細(xì)胞增殖無明顯影響(P＞0.05)。
　　

11、 4.吉西他濱顯著下調(diào)PANC-1細(xì)胞ADAM10 mRNA和蛋白的表達(dá)水平(P＜0.01)。
　　 5.吉西他濱(5ng/ml)作用PANC-1細(xì)胞24小時(shí)后，細(xì)胞表面MICA表達(dá)增強(qiáng)，細(xì)胞上清液中sMICA的含量減少(P＜0.01)。吉西他濱對(duì)PANC-1細(xì)胞MICA mRNA表達(dá)無明顯影響。
　　 6.siRNA下調(diào)ADAM10表達(dá)后，吉西他濱對(duì)PANC-1細(xì)胞表面MICA蛋白的表達(dá)和上清液中sMICA的含量無明顯