吉西他濱磁納米微球的制備及對胰腺癌的殺傷實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、胰腺癌是常見的消化道惡性腫瘤，具有早期診斷困難、病程短、進(jìn)展快、病死率高的特點(diǎn)，中位生存期約為6個月，總體5年生存率低于5％。目前手術(shù)仍是根治胰腺癌的唯一手段，但由于胰腺癌早期癥狀不典型，確診時大多數(shù)患者已屬中晚期，手術(shù)切除率低，僅為5％～15％，因此局部或全身化療仍是治療胰腺癌的重要手段之一。吉西他濱是美國FDA批準(zhǔn)的用于治療進(jìn)展期胰腺癌的一線用藥，對胰腺癌單一或聯(lián)合其它抗癌藥物都取得很高的療效。吉西他濱是一種新型的脫氧胞苷類似物，屬

2、嘧啶類抗代謝類藥物，屬細(xì)胞周期特異性抗腫瘤藥，主要作用于DNA合成期的腫瘤細(xì)胞，即S期細(xì)胞，具有抗瘤譜廣、作用機(jī)制獨(dú)特、與其他化療藥物無交叉耐藥且毒性反應(yīng)無疊加等特點(diǎn)。然而，吉西他濱缺乏組織特異性，全身毒副作用大；體內(nèi)代謝迅速，血漿半衰期短；腫瘤耐藥性等缺點(diǎn)。 近年來隨著生物技術(shù)以及納米技術(shù)的飛速發(fā)展，磁控納米載藥系統(tǒng)在腫瘤靶向治療的應(yīng)用得到了人們的廣泛關(guān)注。磁控納米載藥系統(tǒng)是將化療藥物、磁性內(nèi)核包入高分子材料制成的納米球中，注

3、入體內(nèi)后，它在體外磁場的作用下滯留于靶區(qū)，平穩(wěn)釋放藥物殺傷腫瘤細(xì)胞，同時降低藥物的全身毒副作用，是一種新興的腫瘤靶向治療方法。然而，良好的生物相容性仍是納米醫(yī)用材料的必備條件。殼聚糖為天然堿性多糖，是甲殼素脫乙?；漠a(chǎn)物，具有良好的生物相容性和生物可降解性，在體內(nèi)降解產(chǎn)物能完全被人體吸收，無毒副作用；而鐵元素乃人體必須元素，少量應(yīng)用對人體無毒害作用。目前連接藥物與磁納米粒的常用方法包括物理負(fù)載法、離子交聯(lián)法以及化學(xué)鍵耦連法等，其中由于化

4、學(xué)鍵耦聯(lián)可使載藥磁納米粒更為穩(wěn)定、更能適應(yīng)不同環(huán)境的變化而得到大多數(shù)研究者的喜愛。本研究采用化學(xué)沉淀法，藥物共價耦聯(lián)于體系，粒徑小，體系穩(wěn)定，通過細(xì)胞的攝粒作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，可實(shí)現(xiàn)安全有效的胞內(nèi)靶向藥物治療。 根據(jù)以上內(nèi)容，本論文著眼于胰腺癌靶向治療的需要，整合磁納米技術(shù)及化療技術(shù)，提出以下思路： 1、以羧甲基殼聚糖(carboxymethylated chitosan，CS)及納米級Fe3O4為載體材料，以吉西他濱(Ge

5、mcitabine，Gem)為模型藥物，采用化學(xué)沉淀法制備吉西他濱．羧甲基殼聚糖氧化鐵納米微球(Gemcitabine-carboxymethly-ehitosan magnetic nanoparticles，Gem-CCMN)?？疾霨em-CCMN的形貌、粒徑，測定載藥量及包封率及體外藥物釋放情況。 2、采用四唑鹽顯色法(MTI法)檢測Gem-CCMN對胰腺癌CAPAN-2體外增殖的抑制效應(yīng)，流式細(xì)胞術(shù)(flow cytom

6、etry，F(xiàn)CM)檢測細(xì)胞凋亡。 3、建立裸鼠人胰腺癌皮下移植瘤模型，考察Gem-CCMN協(xié)同外磁場對裸鼠移植瘤的體內(nèi)抑瘤效應(yīng)。 第一部分吉西他濱磁納米微球的制備及結(jié)構(gòu)與性能表征研究 目的： 制備Gem-CCMN及研究其納米表征。 研究內(nèi)容與方法： 本部分內(nèi)容以CS及納米級Fe3O4為載體材料，以Gem為模型藥物，采用化學(xué)沉淀法制備Gem-CCMN，并通過掃描電子顯微鏡(scanning

7、electron microscopy，SEM)觀察磁納米粒形態(tài)，紫外分光光度法(ultraviolet spectrophotometry，US)測定微球的載藥量及包封率，體外考察Gem-CCMN在模擬血漿及溶酶體液條件下藥物累積釋放率。 結(jié)果： Gem-CCMN呈球形，大小較均勻，平均粒徑為(50±4.6)nm，載藥量為(17±2.1)％，包封率為(45±5.3)％；傅立葉變換紅外光譜顯示：Gem的氨基與磁性粒子表面

8、的羧基之間形成穩(wěn)定的肽鍵(-CONH-)；體外藥物釋放表明：Gem-CCMN血漿48h累積釋放量僅22％，而擬溶酶體液條件下藥物累計釋放率可達(dá)82％。 結(jié)論： 以CS和納米級Fe3O4為載體材料，采用化學(xué)沉淀法成功制備出Gem-CCMN，該微球粒徑小，大小均一，具有較好的載藥量和包封率。Gem-CCMN在血漿中較穩(wěn)定，而在擬溶酶體液條件下，隨著PH的降低、胰蛋白酶活性的增加，可加快Gem-CCMN中-CONH-的水解，促

9、進(jìn)微球藥物的釋放。 第二部分Gem-CCMN對人胰腺癌CAPAN-2的體外殺傷研究研究 目的： 考察Gem-CCMN的體外細(xì)胞毒性。 研究內(nèi)容與方法： 采用MTT法測定Gem-CCMN對人胰腺癌細(xì)胞CAPAN-2的增殖抑制率，采用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測CAPAN-2凋亡。 結(jié)果： Gem及Gem-CCMN均明顯抑制CAPAN-2細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和壞死，但彼此無顯著性差異(

10、p>0.05)。而CCMN空載治療組與NS治療組無顯著性差異(p>0.05)。 結(jié)論： Gem-CCMN能有效抑制腫瘤細(xì)胞生長，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及壞死；而空載磁納米粒CCMN對細(xì)胞無殺傷作用，作為藥物載體具有良好的生物相容性。 第三部分Gem—CCMN協(xié)同外磁場對荷人胰腺癌裸鼠的治療效果研究 目的： 考察Gem．CCMN協(xié)同外磁場下對腫瘤的生長抑制。 研究內(nèi)容與方法： 建立裸鼠人胰腺癌

11、皮下移植瘤模型，于移植瘤部位施加恒定外磁場，采用尾靜脈注射給藥方式，通過繪制腫瘤生長曲線以及計算腫瘤質(zhì)量抑制率，考察Gem-CCMN協(xié)同外磁場對移植瘤的治療效果。 結(jié)果： Gem-CCMN協(xié)同磁場治療組的抑瘤率為41.35％，明顯高于其他治療組(p<0.05)；Gem治療組(20.5l％)與Gem-CCMN治療組(18.91％)無顯著性差異(p>0.05)。 結(jié)論： Gem-CCMN在協(xié)同磁場作用下，可有