Pim-3參與人胰腺癌生長(zhǎng)和吉西他濱耐藥的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景: 胰腺癌是一種預(yù)后極差的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其5年生存率不足5％。吉西他濱作為胰腺癌的一線治療藥物，有效率低于20％?；熌退幨羌魉麨I治療胰腺癌失敗的主要原因，耐藥機(jī)制主要有Mdr-1編碼的P-gp蛋白增加藥物外排，以及抗凋亡蛋白Bcl-XL激活后抑制吉西他濱誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。Pim-3作為具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的原癌基因，可以使Bad蛋白112位的絲氨酸發(fā)生磷酸化，削弱與Bcl-XL的結(jié)合作用，從而釋放出抗凋亡蛋白分子Bcl-

2、XL，進(jìn)而發(fā)揮抗凋亡作用。目前尚未有明確證據(jù)證實(shí)Pim-3與胰腺癌吉西他濱耐藥有關(guān)。
　　目的: 本研究的目的是闡明Pim-3促進(jìn)胰腺癌生長(zhǎng)和血管新生的作用，探討Pim-3與吉西他濱耐藥的關(guān)系，明確Pim-3在胰腺癌吉西他濱耐藥中的作用，并分析其作用的分子機(jī)制。
　　方法: 1.將構(gòu)建的穩(wěn)定過(guò)表達(dá)Pim-3以及Pim-3激酶失活的人胰腺癌細(xì)胞株原位接種到裸鼠胰腺，MRI檢測(cè)胰腺腫瘤生長(zhǎng)情況，免疫組化檢測(cè)PCNA、CD31和V

3、EGF蛋白表達(dá)，蛋白免疫印跡雜交分析Pim-3與VEGF的表達(dá)。2.吉西他濱體外處理穩(wěn)定過(guò)表達(dá)Pim-3和穩(wěn)定敲除Pim-3的胰腺癌細(xì)胞株后，利用CCK8試劑盒檢測(cè)吉西他濱的細(xì)胞毒性作用，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡。胰腺癌細(xì)胞株裸鼠胰腺原位接種后，給予吉西他濱處理，測(cè)量裸鼠胰腺原位腫瘤的大小，利用免疫組化檢測(cè)細(xì)胞增殖和血管新生，Tunnel凋亡染色檢測(cè)凋亡細(xì)胞。蛋白免疫印跡雜交檢測(cè)相應(yīng)的胰腺癌細(xì)胞和組織內(nèi)，相關(guān)信號(hào)分子蛋白表達(dá)改變

4、。3.間歇濃度遞增法誘導(dǎo)建立胰腺癌吉西他濱耐藥細(xì)胞株，利用CCK8試劑盒、流式細(xì)胞術(shù)、原位移植腫瘤模型等手段，檢測(cè)耐藥細(xì)胞的生物學(xué)特性。利用RNA干擾技術(shù)敲除耐藥細(xì)胞中的Pim-3后，利用CCK8試劑盒、流式細(xì)胞術(shù)觀察耐藥細(xì)胞株對(duì)吉西他濱耐藥的敏感性，蛋白免疫印跡雜交檢測(cè)細(xì)胞相關(guān)信號(hào)分子表達(dá)變化。
　　結(jié)果: 1.過(guò)表達(dá)Pim-3的胰腺癌細(xì)胞株(Miapaca-2-Pim-3)無(wú)論在體內(nèi)還是體外實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞增殖均明顯高于親本細(xì)胞株

5、Miapaca-2，而且過(guò)表達(dá)Pim-3的細(xì)胞形成的腫瘤組織中，新生血管增多。蛋白免疫印跡雜交和免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)Pim-3的細(xì)胞和組織中，VEGF表達(dá)上調(diào)。2.RT-PCR和Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示吉西他濱可以誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞Pim-3的mRNA水平和蛋白水平表達(dá)上調(diào)，提示Pim-3可能參與了吉西他濱耐藥。體外吉西他濱處理胰腺癌細(xì)胞，結(jié)果顯示，吉西他濱在一定程度上抑制親本細(xì)胞(Miapaca-2)的細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進(jìn)

6、程，并且在一定程度上引起細(xì)胞凋亡。過(guò)表達(dá)Pim-3可以拮抗吉西他濱的上述細(xì)胞毒作用。進(jìn)一步裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，過(guò)表達(dá)Pim-3可以拮抗吉西他濱介導(dǎo)的腫瘤生長(zhǎng)抑制和細(xì)胞凋亡;相反地，胰腺癌細(xì)胞敲除Pim-3的表達(dá)，對(duì)吉西他濱的細(xì)胞毒作用起到增敏效果。蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，吉西他濱誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞Pim-3表達(dá)上調(diào)的同時(shí)，抗凋亡蛋白Bcl-XL和細(xì)胞周期相關(guān)分子Cdc25A、Cdc25C表達(dá)也增加。這些結(jié)果提示，Pim-3可能通過(guò)調(diào)節(jié)

7、細(xì)胞增殖，細(xì)胞周期和凋亡，參與胰腺癌吉西他濱的耐藥。3.間歇濃度遞增法誘導(dǎo)的胰腺癌吉西他濱耐藥細(xì)胞株，在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)裸鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示，與親本胰腺癌Miapaca-2細(xì)胞相比較，耐藥細(xì)胞能夠拮抗吉西他濱誘導(dǎo)的周期阻滯和細(xì)胞凋亡。RT-PCR和Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示吉西他濱耐藥細(xì)胞株中Pim-3的mRNA以及蛋白水平表達(dá)均上調(diào)。敲除耐藥細(xì)胞Pim-3表達(dá)后，耐藥細(xì)胞對(duì)吉西他濱敏感性增加。蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，耐藥細(xì)

8、胞株P(guān)im-3蛋白表達(dá)上調(diào)的同時(shí)，多藥耐藥基因編碼的蛋白P-gp、抗凋亡蛋白分子Bcl-XL、細(xì)胞周期相關(guān)分子蛋白Cdc25A、Cdc25C表達(dá)也增加;敲除耐藥細(xì)胞Pim-3表達(dá)后，P-gp、Bcl-XL、 Cdc25A、Cdc25C表達(dá)減少。這些結(jié)果進(jìn)一步提示了，Pim-3通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，細(xì)胞周期和凋亡，參與胰腺癌吉西他濱的耐藥。
　　結(jié)論: 1.Pim-3通過(guò)上調(diào)VEGF表達(dá)從而促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞體內(nèi)生長(zhǎng)和血管新生。2.吉西他濱

9、能夠誘導(dǎo)Pim-3 mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步通過(guò)上調(diào)抗凋亡蛋白分子Bcl-XL和細(xì)胞周期相關(guān)分子Cdc25A、Cdc25C蛋白表達(dá)從而拮抗吉西他濱誘導(dǎo)的胰腺癌細(xì)胞凋亡和周期阻滯。3.間歇濃度遞增法可以誘導(dǎo)Miapaca-2對(duì)吉西他濱耐藥，成功建立耐藥細(xì)胞株，在Miapaca-2細(xì)胞獲得性耐藥中Pim-3表達(dá)上調(diào)，并且通過(guò)促進(jìn)P-gp表達(dá)和增加抗凋亡蛋白分子Bcl-XL、細(xì)胞周期相關(guān)分子蛋白Cdc25A、Cdc25C表達(dá)，誘導(dǎo)耐藥細(xì)