葫蘆素B與吉西他濱聯合應用對胰腺癌的抑制作用及其機理研究.pdf

1、實驗目的: 胰腺癌是一種常見的消化道惡性腫瘤。據世界衛(wèi)生組織統計，世界上每年胰腺癌新發(fā)病例約為21.6萬人，占全部惡性腫瘤的2％，但是胰腺癌的死亡率非常高，與發(fā)病率十分接近，在癌癥死因中占第4位。胰腺癌的治療仍然是非常棘手的臨床問題。手術切除是目前首選的治療方式，但由于受胰腺解剖學及生物學特征等因素的影響，確診時多屬晚期，手術切除的機會只有15％～20％甚至更低，而且術后仍有復發(fā)轉移。近年來，胰腺癌的藥物治療已經有了顯著的進步，

2、化療已成為必不可少的治療手段之一，分子靶向藥物治療也已成為目前研究的熱點。 信號轉導子和轉錄激活子(signal transducers and activators of transcription，STATs)是1992年研究干擾素誘導基因轉錄時首次鑒定的一個胞漿蛋白家族，是根據它們在信號轉導中的作用來命名的，它們接收特異的細胞表面受體信號并進行轉導，從而使細胞內其下游靶基因的轉錄發(fā)生改變。迄今為止，人們已經確認了7種不同的

3、STAT分子，包括STAT1、2、3、4、5a、5b和6。STAT3是其重要成員，在許多人類腫瘤中活化，具有強烈的抑制細胞凋亡、促進細胞增殖的作用，參與了人類惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。近年來，以STAT3為靶點的治療措施取得了很大進展，通過直接或間接阻斷STAT3信號通路抑制腫瘤細胞和異種移植瘤的STAT3活化，抑制腫瘤細胞增殖，促進凋亡。 葫蘆素(Cucurbitacins)是從葫蘆科及其它科屬多種植物中提取的成分，至今已發(fā)現40

4、多種，其中以葫蘆素B、E應用最廣。葫蘆素具有抗腫瘤、抗化學致癌、保肝、提高機體免疫力等多種生物活性。近年的多項研究表明，葫蘆素B、D、E、I、Q等是JAK/STAT3信號通路的特異抑制劑，能降低多種癌細胞的STAT3活化水平，并降低STAT3的DNA結合能力和STAT3介導的基因轉錄，抑制腫瘤細胞增殖，誘導腫瘤細胞凋亡，抑制異種移植瘤生長。J ayaprakasam等報道，葫蘆素B對結腸癌、乳腺癌、肺癌和中樞神經系統腫瘤都有明顯的抑制作

5、用。我們前期的研究顯示葫蘆素B對喉癌和肝癌也具有增殖抑制作用，但關于葫蘆素B對胰腺癌的作用尚未見報道。 吉西他濱(gemcitabine，difluorodeoxycytidin，dFdC)是晚期胰腺癌的標準治療藥物，但單用吉西他濱對患者生存期的影響還很有限，因此除了不能耐受強烈化療或參加新藥試驗的患者，臨床上經常采用聯合化療治療晚期胰腺癌。目前多采用吉西他濱聯合其他抗腫瘤藥物，包括：一些傳統藥物如5—氟尿嘧啶、鉑類藥物，新一代

6、細胞毒藥物如多西紫杉醇以及分子靶向藥物如埃羅替尼等。吉西他濱聯合化療與其單藥應用相比，能夠提高總生存期、客觀緩解率及無進展生存期等，但患者5年生存率仍較低。吉西他濱與分子靶向藥物聯合是目前研究的熱點，且有關葫蘆素B與吉西他濱聯合應用對胰腺癌抑制作用的研究尚未見報道。 本研究應用MTT法、流式細胞術、熒光染色、活性氧(reactive oxygen species，ROS)檢測以及Western blot等方法，研究葫蘆素B單獨或

7、聯合吉西他濱對胰腺癌細胞系PANC—1體外的增殖抑制作用，并探討其機理。 材料和方法: 不同濃度葫蘆素B單獨或聯合吉西他濱作用于PANC—1細胞一定時間后，利用MTT法檢測計算細胞增殖抑制率并探討兩者聯合是否具有協同作用，流式細胞儀PI單染檢測細胞周期分布的變化，Hoechst33258核染色熒光顯微鏡觀察細胞凋亡的形態(tài)學變化，流式細胞儀Annexin V/PI雙標記法檢測細胞凋亡率，活性氧探針(2，7—二氯熒光素)探測

8、PANC—1細胞內活性氧水平的變化，最后利用Western Blot技術檢測細胞內p—STAT3及凋亡相關蛋白Bcl—2、p53及其下游蛋白p21等的表達。 結果: 1、MTT法實驗結果顯示葫蘆素B與吉西他濱單獨或是聯合應用，對PANC—1細胞的增殖抑制作用具有明顯的劑量依賴性和時間依賴性。經單因素方差分析，P<0.01。經LSD-T檢驗，用藥組與對照組之間、高劑量組與低劑量組之間、不同時間組之間以及聯合用藥組與單藥組之

9、間，差異均有統計學意義(P<0.05或<0.01)。 2、PI單染流式細胞儀檢測結果顯示葫蘆素B導致PANC—1細胞G2/M期阻滯，同時伴有G0/G1期細胞減少，并具有劑量依賴性和時間依賴性；吉西他濱則使阻滯于S期的細胞增多；兩者聯合應用，同時阻滯細胞于S期和G2/M期，且阻滯細胞所占比例明顯升高。經單因素方差分析，P<0.01。經LSD-T檢驗，不同劑量組之間、不同時間組之間及其與對照組之間、以及聯合組與單藥組之間的差異均有統

10、計學意義(P<0.05或<0.01)。 3、Hoechst33258染色熒光顯微鏡觀察發(fā)現，隨著葫蘆素B或吉西他濱濃度增加和作用時間延長，細胞形態(tài)發(fā)生顯著性改變，凋亡細胞明顯增多，甚至出現大片細胞脫落形成細胞脫失區(qū)，兩藥聯合應用后效果更加明顯。經單因素方差分析，具有統計學意義。經LSD-T檢驗，P<0.05或<0.01。 4、Annexin V/PI雙染流式細胞儀檢測結果顯示，聯合用藥組較陰性對照組和單藥組細胞凋亡比例明

11、顯升高。經單因素方差分析，具有統計學意義。經LSD-T檢驗，不同濃度組與對照組之間、各濃度組之間以及聯合組與單藥組之間，P<0.01。 5、活性氧探針(2，7—二氯熒光素)檢測結果顯示，葫蘆素B或吉西他濱單獨作用于PANC—1細胞后胞內活性氧水平升高，并呈時間和劑量依賴性。兩者聯合作用下細胞內活性氧水平顯著升高。經單因素方差分析，具有統計學意義。經LSD-T檢驗，不同濃度組與對照組之間、聯合用藥組與單藥組之間相比較，P<0.01

12、。 6、Western blot結果顯示葫蘆素B可以時間和劑量依賴性抑制STAT3的磷酸化和抗凋亡基因Bcl—2的蛋白表達，活化抑癌蛋白p53和p21的表達。兩藥聯合作用，pSTAT3則幾乎完全被抑制，p53蛋白水平表達較對照組升高。 結論: 1、葫蘆素B可以劑量和時間依賴性抑制胰腺癌PANC—1細胞的生長；葫蘆素B和吉西他濱聯合應用共同抑制PANC—1細胞的增殖抑制，且作用較單藥明顯。 2、葫蘆素B抑制

13、胰腺癌PANC—1細胞的作用是通過誘導細胞G2/M期阻滯和凋亡來實現的，并具有劑量和時間依賴性；兩藥聯合作用細胞同時阻滯于S期和G2/M期，且阻滯細胞比例較單藥組明顯增加。 3、葫蘆素B可以劑量依賴性地增加胰腺癌細胞內ROS的產生；兩藥聯合作用，細胞內ROS水平增加顯著。 4、葫蘆素B抑制胰腺癌PANC—1細胞的作用機理可能是通過抑制STAT3信號通路的活化，進而抑制抗凋亡基因Bcl—2的表達，增強p53和p21蛋白的表