白楊素通過抑制自噬增強胰腺癌吉西他濱化療敏感性的實驗研究.pdf

1、第一部分白楊素抑制胰腺癌細胞增殖并誘導其線粒體途徑凋亡
　　目的：研究黃酮類化合物白楊素對人胰腺癌細胞增殖、凋亡等的影響及其可能的機制。方法細胞增殖活性采用 CCK-8法和克隆平板試驗檢測；細胞凋亡采用 Annexin V–FITC/PI雙標流式細胞術檢測；細胞周期采用PI單標流式細胞術檢測；免疫印跡法檢測凋亡相關蛋白的表達。
　　結果：白楊素能抑制胰腺癌細胞增殖和克隆形成，且這種作用呈時間和濃度依賴性；白楊素能阻滯細胞周期

2、于G0/G1期，并誘導胰腺癌細胞發(fā)生凋亡；免疫印跡結果顯示，白楊素能引起PARP、Caspase-9、Caspase-3剪切體的激活，同時上調Bax/Bcl-2的比值。
　　結論：白楊素能抑制人胰腺癌細胞增殖和克隆形成能力，并阻滯細胞周期于G0/G1期；白楊素能夠誘導胰腺癌細胞發(fā)生線粒體途徑凋亡。
　　第二部分白楊素通過抑制溶酶體酶活性阻斷胰腺癌細胞自噬
　　目的：研究白楊素對人胰腺癌細胞自噬的影響及其可能的機制。

3、r>　　方法：構建攜帶GFP標簽的LC3過表達慢病毒載體并穩(wěn)定轉染胰腺癌細胞株，激光共聚焦顯微鏡觀察細胞內 GFP-LC3點狀聚集的數目；免疫印跡法檢測自噬相關蛋白的表達情況；免疫熒光法檢測自噬底物p62蛋白的表達；采用透射電子顯微鏡觀察細胞超微結構的變化；構建攜帶GFP和mRPF雙標簽的LC3過表達慢病毒載體并穩(wěn)定轉染胰腺癌細胞株，激光共聚焦顯微鏡觀察細胞內GFP-LC3和mRFP-LC3共定位關系；利用溶酶體探針LysoTracke

4、r Red檢測溶酶體與GFP-LC3之間的空間定位關系；采用AO（吖啶橙）染色觀察細胞內酸性自噬泡的數目；采用組織蛋白酶活性測定試劑盒檢測細胞內組織蛋白酶的活性情況。
　　結果：共聚焦結果顯示，白楊素能導致穩(wěn)定轉染GFP-LC3過表達慢病毒的胰腺癌細胞內出現(xiàn)大量GFP-LC3點狀聚集，且這種作用呈濃度和時間依賴性；同時，這種GFP-LC3綠色熒光與 LysoTracker Red紅色熒光具有共定位關系；免疫印跡和免疫熒光結果顯示，

5、白楊素可誘導胰腺癌細胞自噬關鍵蛋白LC3-Ⅱ的表達增加，而自噬底物蛋白p62表達也增加；電鏡結果顯示，白楊素能誘導胰腺癌細胞胞質內形成大量自噬泡；免疫印跡結果顯示，溶酶體抑制劑CQ與白楊素聯(lián)合作用后，LC3-Ⅱ的表達較單用CQ組無明顯增加；與CQ作用相似，白楊素能誘導穩(wěn)定轉染GFP-mRPF-LC3過表達慢病毒的胰腺癌細胞內 GFP-LC3和 mRFP-LC3熒光共定位，而自噬激活劑 Rap作用后mRFP-LC3熒光顯著高于GFP-LC

6、3；AO染色結果顯示，白楊素與CQ均能顯著增加胰腺癌細胞內酸性自噬泡的數量；組織蛋白酶活性檢測和免疫印跡結果顯示，白楊素能抑制胰腺癌細胞內組織蛋白酶B和組織蛋白酶D的活性。
　　結論：白楊素通過抑制溶酶體酶活性阻斷胰腺癌細胞自噬。
　　第三部分白楊素通過抑制自噬增強胰腺癌細胞對吉西他濱化療敏感性
　　目的：探討白楊素聯(lián)合吉西他濱對胰腺癌細胞增殖、凋亡的影響及其機制。
　　方法：細胞增殖活性采用CCK-8法檢測；細

7、胞凋亡采用Annexin V–FITC/PI雙標流式細胞術檢測；倒置顯微鏡觀察藥物單用或聯(lián)用對細胞形態(tài)的影響；免疫印跡法檢測自噬和凋亡相關蛋白的表達；采用RNAi技術沉默自噬關鍵基因Beclin1、ATG5、ATG7后檢測吉西他濱對胰腺癌細胞增殖、凋亡作用的變化。
　　結果：吉西他濱能通過濃度和時間依賴性方式部分抑制胰腺癌細胞增殖；免疫印跡結果顯示，吉西他濱可誘導胰腺癌細胞 LC3-Ⅱ的表達增加，而自噬底物蛋白 p62則表達減少；

8、吉西他濱與溶酶體抑制劑CQ合用后，LC3-Ⅱ的表達較單用CQ顯著增加；無論是聯(lián)合自噬抑制劑 CQ或是沉默自噬關鍵基因 Beclin1、ATG5、ATG7后，均能顯著增加吉西他濱對胰腺癌細胞的殺傷效果；當吉西他濱與白楊素聯(lián)合使用后， LC3-Ⅱ的表達較二者單用顯著增加；同時，兩藥聯(lián)用較單藥使用更能抑制胰腺癌細胞活性并誘導細胞凋亡，而在聯(lián)用基礎上加入CQ后并未增加細胞殺傷效果；免疫印跡結果顯示，兩藥聯(lián)用較單藥使用更能增加PARP、Caspa