hENT-1，DCK，RRM1和RRM2的表達與胰腺癌吉西他濱輔助化療敏感性研究.pdf

1、目的:
　　近年來胰腺癌的發(fā)病率在國內外均呈明顯上升趨勢，且預后極差，其五年生存率低于5％。即使術后輔助化療的病人，5年生存期仍只有10％～30％。以吉西他濱為主的化療方案是胰腺癌化療的標準方案。而吉西他濱耐藥仍然是延長患者總生存期(overall survival，OS)和無病生存期(disease free survival，DFS)的重要阻礙。因此，預測胰腺癌術后患者的化療耐藥性，從而選擇最佳的化療方案，實現(xiàn)更好的個體化治療

2、，對提高胰腺癌患者的生存具有重大意義。
　　吉西他濱是一種很強的親水性藥物，不能以被動擴散的方式穿過細胞膜，而主要通過人平衡型核苷轉運體1(human equilibrative nucleoside transporter-1，hENT-1)進入胞漿。在胞漿中，吉西他濱在被脫氧胞苷激酶(deoxycytidine kinase，DCK)磷酸化成雙氟脫氧胞苷一磷酸(difluorodeoxycytdine monophosphat

3、e，dFdCMP)，隨后，DCK將dFdCMP轉換成其活性代謝物，即雙氟脫氧胞苷二磷酸（difluorodeoxycytidine diphosphate, dFdCDP）及雙氟脫氧胞苷三磷酸(difluorodeoxycytidine triphosphate，dFdCTP)。dFdCDP和dFdCTP通過抑制核苷酸還原酶（ribonucleotide reductase，RR）來阻礙三磷酸脫氧核苷酸(deoxynucleotide

4、triphosphates)的生成，而三磷酸脫氧核苷酸是合成DNA的必需材料。RR由其大亞基核苷酸還原酶M1(ribonucleoside reductase subunitM1，RRM1)和小亞基核苷酸還原酶M2(ribonucleoside reductase subunit M2，RRM2)組成。
　　近年來，國外關于吉西他濱敏感性的研究逐漸增多，hENT-1，DCK，RRM1和RRM2等幾種吉西他濱代謝相關的基因也各有報道

5、，但關于這幾種基因能否預測胰腺癌患者吉西他濱輔助化療的敏感性，結論尚有爭議，不能對臨床產生較大的指導意義。并且到目前為止，還沒有關于中國胰腺癌人群的大宗報道。
　　本課題擬回顧性分析我院2005.1月到2011.6月期間收治的胰腺癌術后患者，其hENT-1，DCK，RRM1和RRM2表達與吉西他濱輔助化療敏感性的關系，為其應用于臨床提供證據(jù)。
　　方法:
　　一、病人的篩選及病例資料的收集和總結
　　我們收集了從

6、2005.1月到2011.6月我院收治的所有病理確診為胰腺導管腺癌的行腫瘤切除術病人的臨床資料。剔除接受新輔助化療、放化療、非吉西他濱化療、R2切除的病人及術后1月內死亡、隨訪信息不全的病例，共篩選出102例病人，其中45例術后未行化療，為非化療組（對照組），57例術后行至少3個周期的吉西他濱或GEMOX(吉西他濱+奧沙利鉑)方案的化療，為化療組（實驗組）。兩組性別，年齡，手術方式，Rx(R0或R1)切除，臨床分期，病理分級，腫瘤大小等

7、臨床指標相匹配，無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。設立對照組，以期排除hENT-1，DCK，RRM1，RRM2基因的表達本身即為胰腺癌術后患者的獨立預后因素的可能，進而證明其僅在吉西他濱輔助化療的患者中發(fā)揮作用。
　　二:免疫組化及結果評級
　　我們收集了此102例病人的福爾馬林固定石蠟包埋的腫瘤組織蠟塊，HE染色的切片用來確認病理類型為胰腺導管腺癌。組織蠟塊切成小于4um厚度的連續(xù)切片，做hENT-1，DCK，RRM1，RRM

8、2的蛋白免疫組化。并由本人與本院病理科程潤芬醫(yī)生分別評級。結合雙方的組化評級結果，評分不一致的請本院病理科孫燕副主任醫(yī)師評定。
　　三:QRT-PCR及結果計算
　　102例胰腺癌病人中可收集到53例病人的新鮮冰凍腫瘤組織，其中化療組24人，非化療組29人。兩組性別，年齡，手術方式，Rx(R0或R1)切除，臨床分期，病理分級，腫瘤大小等臨床指標相匹配，無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。我們采用RNA提取試劑盒從這53例病人的新鮮

9、冰凍腫瘤組織中提取全RNA，反轉錄并用QRT-PCR驗證hENT-1，DCK，RRM1，RRM2在mRNA水平表達與吉西他濱化療敏感性的關系。
　　四:結果分析
　　在化療組和非化療組中分別分析hENT-1，DCK，RRM1，RRM2四個基因在蛋白組化水平及mRNA水平與患者OS和DFS的關系。
　　結果:
　　一:蛋白水平
　　1.患者總生存期(OS)分析
　　非化療組中，RRM1蛋白表達為患者OS

10、的獨立相關因素。RRM1蛋白高表達組生存期較高，這與相關文獻報道一致?；熃M中，RRM2，hENT-1的蛋白表達是患者OS的獨立相關因素。RRM2低表達組、hENT-1高表達組分別擁有較長的OS。
　　2.患者無瘤生存期(DFS)分析
　　非化療組中，RRM1的蛋白表達為患者DFS的獨立相關因素。RRM1蛋白高表達組的患者DFS較長。化療組中，RRM2，hENT-1的蛋白表達為患者DFS的獨立相關因素。RRM2低表達組、hE

11、NT-1高表達組分別擁有較長的DFS。
　　二:mRNA水平
　　1.患者總生存期(OS)分析
　　兩組中，hENT-1，DCK，RRM1，RRM2的mRNA表達均非患者OS的獨立相關因素?；熃M中，hENT-1 mRNA高表達組的生存期較長，但達不到統(tǒng)計學差異(P=0.091)。
　　2.患者無瘤生存期(DFS)分析
　　非化療組中，hENT-1，DCK，RRM1，RRM2的mRNA表達均非患者DFS的獨

12、立相關因素。化療組中，hENT-1 mRNA的表達為患者DFS的獨立相關因素。
　　結論:
　　RRM2，hENT-1的蛋白水平的表達是吉西他濱輔助化療患者DFS和OS的獨立相關因素，RRM2低表達組、hENT-1高表達組分別擁有較長的DFS和OS。在mRNA水平，僅hENT-1為吉西他濱輔助化療患者DFS的獨立相關因素。RRM2，hENT-1免疫組化染色的方法，操作簡單，靈敏度高，重復性強，有望成為預測胰腺癌患者術后吉西他