IRF-2在胰腺癌中的功能及其對(duì)胰腺癌細(xì)胞化療敏感性的影響.pdf

1、胰腺癌是一種惡性程度很高的腫瘤。雖然近年來(lái)診斷和治療技術(shù)不斷提高，但胰腺癌病人生存狀況仍不容樂(lè)觀，這與胰腺癌發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，多種基因參與調(diào)控，缺少有效的治療靶點(diǎn)等有關(guān)。干擾素調(diào)控因子2(IRF-2)是干擾素調(diào)控因子家族的一員，其功能涉及免疫調(diào)節(jié)和腫瘤的發(fā)生發(fā)展。已有的研究表明，干擾素調(diào)控因子2參與了乳腺癌、黑色素瘤、食管癌等多種腫瘤的形成，但是其在胰腺癌中還未見(jiàn)系統(tǒng)性的功能研究。
　　 在本課題中，我們研究了IRF-2基因在胰腺癌

2、中的功能，著重進(jìn)行了以下四個(gè)部分的工作：(1)構(gòu)建IRF-2基因RNA干擾的載體，并在胰腺癌細(xì)胞系中穩(wěn)定沉默IRF-2的表達(dá)；(2)研究IRF-2對(duì)胰腺癌細(xì)胞系生長(zhǎng)、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)特性的影響，并進(jìn)一步闡述其機(jī)制；(3)探討胰腺癌細(xì)胞IRF-2沉默以后對(duì)吉西他濱化療敏感性的影響；(4)結(jié)合臨床數(shù)據(jù)，探討IRF-2在胰腺癌臨床樣本中的表達(dá)情況，并分析IRF-2的表達(dá)與病人臨床病理指標(biāo)及預(yù)后的關(guān)系。
　　 第一部分：IRF-

3、2基因siRNA載體的構(gòu)建
　　 目的：構(gòu)建IRF-2基因的siRNA載體，并檢測(cè)其效果。
　　 方法：首先設(shè)計(jì)針對(duì)IRF-2 mRNA不同位點(diǎn)的特異性siRNA序列，合成寡核苷酸，然后將其連接到pBS/hU6-1載體上；選擇合適的酶切位點(diǎn)與慢病毒載體FG12相連，瓊脂糖電泳及測(cè)序鑒定。然后進(jìn)行大腸桿菌轉(zhuǎn)化，質(zhì)粒大量抽提。獲得的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝。最后用病毒感染胰腺癌細(xì)胞，檢測(cè)干擾效果。
　　 結(jié)

4、果：本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建連有IRF-2特異性siRNA序列的pBS/hU6-1載體；并成功將序列轉(zhuǎn)移到FG12慢病毒載體上。在包裝病毒及感染胰腺癌細(xì)胞系后，用Western blot檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明效果較好，成功構(gòu)建了下調(diào)IRF-2表達(dá)的MIAPaCa-2和PANC-1胰腺癌細(xì)胞株。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建IRF-2 siRNA載體，獲得下調(diào)IRF-2表達(dá)的穩(wěn)定胰腺癌細(xì)胞株。
　　 第二部分沉默IRF-2對(duì)胰腺癌細(xì)胞生物學(xué)特性

5、的影響
　　 目的：研究沉默IRF-2表達(dá)對(duì)胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等的影響。
　　 方法：在得到穩(wěn)定干擾IRF-2表達(dá)的胰腺癌細(xì)胞株后，通過(guò)MTT、BrdU摻入實(shí)驗(yàn)、結(jié)晶紫實(shí)驗(yàn)、軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)、裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)、裸鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)等檢驗(yàn)胰腺癌細(xì)胞系生長(zhǎng)、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)特點(diǎn)的變化，并且進(jìn)一步從細(xì)胞周期改變及細(xì)胞凋亡方面闡述其機(jī)制。
　　 結(jié)果：MTT實(shí)驗(yàn)、BrdU摻入實(shí)驗(yàn)、結(jié)晶紫

6、實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)沉默IRF-2的表達(dá)抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖能力(P<0.05)。軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)、裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)表明下調(diào)IRF-2的表達(dá)以后胰腺癌細(xì)胞株的成瘤能力明顯下降。流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明下調(diào)IRF-2的表達(dá)后胰腺癌細(xì)胞株的凋亡比例明顯上升(P<0.05)，細(xì)胞G0-G1期阻滯增加，S期細(xì)胞比例明顯下降(P<0.05)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明下調(diào)IRF-2的表達(dá)后，與生長(zhǎng)、增殖相關(guān)的基因：PCNA、CyclinD1明顯下調(diào)；與凋亡相關(guān)的PARP、

7、BAX、Caspase-8基因明顯上調(diào)。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)、裸鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)下調(diào)IRF-2的表達(dá)對(duì)胰腺癌細(xì)胞系侵襲、轉(zhuǎn)移沒(méi)有明顯影響。
　　 結(jié)論：下調(diào)IRF-2表達(dá)對(duì)于MIAPaCa-2和PANC-1胰腺癌細(xì)胞株的生長(zhǎng)、增殖和成瘤能力有著明顯的抑制作用，而這種作用是通過(guò)改變細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)；但是下調(diào)IRF-2表達(dá)對(duì)于細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力沒(méi)有明顯的影響。
　　 第三部分沉默IRF-2對(duì)胰腺癌細(xì)胞化療敏感性的影響

8、>　　 目的：探討沉默IRF-2以后對(duì)胰腺癌細(xì)胞吉西他濱化療敏感性的影響。
　　 方法：MTT檢測(cè)吉西他濱對(duì)胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1和MIAPaCa-2的半數(shù)有效劑量(IC50)，了解這兩種細(xì)胞對(duì)吉西他濱的化療敏感程度，選取相對(duì)耐藥的細(xì)胞進(jìn)一步探討沉默IRF-2表達(dá)對(duì)細(xì)胞吉西他濱的化療敏感性的影響。MTT檢測(cè)干擾IRF-2基因后細(xì)胞對(duì)吉西他濱敏感性的變化。結(jié)晶紫實(shí)驗(yàn)和裸鼠移植瘤模型檢測(cè)干擾IRF-2后是否增強(qiáng)吉西他濱對(duì)體外細(xì)胞

9、克隆形成及體內(nèi)成瘤能力的抑制作用。流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)沉默IRF-2基因前后細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡情況，Western blot檢測(cè)與細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)情況，并探討可能的機(jī)制。
　　 結(jié)果：PANC-1和MIAPaCa-2細(xì)胞中均表達(dá)IRF-2基因，在PANC-1細(xì)胞中高于MIAPaCa-2細(xì)胞。不同濃度藥物作用72小時(shí)，吉西他濱對(duì)PANC-1細(xì)胞的半數(shù)有效劑量為16.5±2.1μg/ml，而MIAPaCa-2細(xì)胞為5.6±1

10、.2μg/ml(P<0.05)。接著，我們利用構(gòu)建的PANC-1對(duì)照細(xì)胞和PANC-1干擾IRF-2表達(dá)的細(xì)胞，不同濃度藥物作用72小時(shí)，吉西他濱對(duì)PANC-1對(duì)照細(xì)胞的IC50值為16.3±1.5μg/ml，干擾IRF-2表達(dá)的細(xì)胞IC50值為9.5±1.4μg/ml(P<0.05)，說(shuō)明下調(diào)IRF-2基因表達(dá)后，PANC-1細(xì)胞對(duì)吉西他濱的敏感性顯著增加。在結(jié)晶紫實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照細(xì)胞+PBS組相比，對(duì)照細(xì)胞+吉西他濱組及干擾IRF-2

11、表達(dá)的細(xì)胞+PBS組克隆形成能力下降(P<0.05)，而干擾IRF-2表達(dá)的細(xì)胞+吉西他濱組克隆形成能力明顯下降(P<0.01)。裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步說(shuō)明了下調(diào)IRF-2表達(dá)后，PANC-1細(xì)胞對(duì)吉西他濱的敏感性明顯增強(qiáng)。同樣，流式細(xì)胞技術(shù)表明，同其他三組相比，干擾IRF-2表達(dá)的細(xì)胞+吉西他濱組G1期細(xì)胞比例增加(P<0.05)，S期細(xì)胞比例降低(P<0.05)，細(xì)胞凋亡比例增高(P<0.01)；與其他三組細(xì)胞相比，干擾IRF-2表

12、達(dá)的細(xì)胞+吉西他濱組Cyclin D1和PCNA表達(dá)水平下降，而與細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因如切割的PARP、BAX和caspase-8增加。
　　 結(jié)論：慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)特異性沉默IRF-2表達(dá)，增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞PANC-1對(duì)吉西他濱的化療敏感性。
　　 第四部分 IRF-2在胰腺癌臨床樣本中的表達(dá)及與臨床病理指標(biāo)和預(yù)后的關(guān)系
　　 目的：研究IRF-2在胰腺癌臨床樣本中的表達(dá)情況，并分析IRF-2的表達(dá)與臨床

13、病理指標(biāo)及預(yù)后的關(guān)系。
　　 方法：選取30例胰腺癌病人臨床新鮮樣本，利用免疫組織化學(xué)染色、蛋白免疫印跡、實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)IRF-2的表達(dá)情況；選取156例胰腺癌病人臨床石蠟樣本制作組織芯片，利用免疫組織化學(xué)染色進(jìn)行評(píng)分；分析IRF-2的表達(dá)與病人臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系，探討IRF-2對(duì)病人臨床特征及預(yù)后的影響。
　　 結(jié)果：與正常對(duì)照胰腺組織相比，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明在胰腺癌中IRF-2高表達(dá)比例為66.7％

14、；免疫組化和Western blot表明IRF-2在癌組織中高表達(dá)。組織芯片結(jié)果表明IRF-2的表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)，在癌組織中高表達(dá)比例為77.6％；統(tǒng)計(jì)分析表明IRF-2的表達(dá)與病人的TNM分期、腫瘤分化程度、腫瘤T分期有關(guān)：TNM分期(X2=21.297；P<0.001)；腫瘤分化程度(X2=10.197；P=0.006)；腫瘤T分期(X2=14.512；P=0.001)；U檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步確定這一結(jié)論。Kaplan-Mei