胰腺癌體外藥物敏感性實驗及化療增敏作用研究.pdf

1、隨著循證醫(yī)學(xué)模式的發(fā)展，充分利用現(xiàn)有的科學(xué)技術(shù)，根據(jù)病人的具體情況采取個體化的化療方案是當(dāng)前腫瘤治療研究的熱點。當(dāng)前化療方案的選擇多是經(jīng)驗用藥，多采用目前認為療效最佳的化療方案，這種化療方案在大樣本檢驗可以是最佳的化療方案，然而針對于特定的病人，并不總是這種化療方案最有效，有研究表明，采用個體化的化療方案能顯著提高腫瘤的化療緩解率。 目前篩選化療方案的方法主要有化療藥物敏感性實驗和檢測耐藥基因的表達。由于體外藥物敏感性實驗的影響

2、因素眾多及實驗方法的多樣性，目前尚沒統(tǒng)一的實驗條件和評價體系，因而在評價體外藥物敏感性實驗的預(yù)測準確性一直存在爭議。因此，分析胰腺癌體外藥物敏感性實驗的影響因素，實現(xiàn)實驗條件的統(tǒng)一，可以使體外藥物敏感性實驗的結(jié)果更具有可比性，有助于得到較為滿意的藥物敏感性評價指標。 部分胰腺癌病人對大多數(shù)化療藥物均不敏感，即便篩選出最優(yōu)化的化療方案，仍有可能導(dǎo)致化療失敗。探索化療增敏作用的方法有助于提高胰腺癌的化療療效。目前用于化療增敏的方法主

3、要有鈣離子拮抗劑、反義技術(shù)、單抗技術(shù)及RNAi技術(shù)等。其中RNAi技術(shù)是轉(zhuǎn)錄后水平的抑制，可聯(lián)合其他方法在不同水平協(xié)同發(fā)揮阻遏表達的作用，而且表達的產(chǎn)物不需要特殊修飾，因而結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，抑制效率較高。腫瘤細胞分泌生長因子是導(dǎo)致腫瘤細胞多藥耐藥的重要機制，PCDGF既可以與EGFR結(jié)合調(diào)節(jié)腫瘤細胞生長增殖，參與耐藥機制，還可以調(diào)節(jié)β-TGF、VEGF、FGF等的表達。因而PCDGF可能是生長因子信號途徑中的重要調(diào)節(jié)因子。 在王春友教授

4、和黃韜教授的指導(dǎo)和支持下，我在普外實驗室開展了腫瘤體外藥物敏感性實驗的前期研究工作，我們發(fā)現(xiàn)同一種腫瘤細胞在不同的實驗條件下其結(jié)果可以有很大的差異。國內(nèi)外在體外藥物敏感性實驗方法和評價標準上的報道也都有較大的差異。因而要實現(xiàn)通過實驗結(jié)果準確判斷化療藥物敏感性，首先需要統(tǒng)一實驗條件，采用合理的評價指標，實現(xiàn)藥物之間的可比性。為此，我們綜合分析實驗條件對結(jié)果的影響，得到較為科學(xué)的實驗條件和評價指標，進一步通過和體內(nèi)療效比較，評價體外實驗的符

5、合性情況。我們還構(gòu)建了針對PCDGF的RNAi質(zhì)粒，評價其作為化療增敏方法的價值。為提高胰腺癌化療療效提供實驗數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)。 第一部分 胰腺癌細胞的原代分離純化和初步鑒定 目的： 探討胰腺癌原代細胞分離的方法和難點，研究能穩(wěn)定分離出胰腺癌原代細胞的方法，為胰腺癌原代細胞體外藥物敏感性實驗提供純化的原代細胞。 方法： 采用膠原酶消化法對新鮮的手術(shù)切除的胰腺癌組織進行消化，過濾，再用差數(shù)貼壁

6、法去除部分雜質(zhì)細胞，經(jīng)免疫組化檢測粘蛋白的表達以鑒定分離純化后的細胞成分。 結(jié)果： 23例胰腺癌組織經(jīng)消化后，17例成功分離到胰腺癌原代細胞并穩(wěn)定生長，經(jīng)差數(shù)貼壁純化后，免疫組化檢測到上皮來源的細胞占所有細胞的比例為(85±7)％。 結(jié)論： 膠原酶消化法和差數(shù)貼壁法可以很好的獲得胰腺癌原代細胞，為胰腺癌體外藥敏實驗提供對象。 第二部分 胰腺癌體外藥物敏感實驗的影響因素及評價體系的建立

7、 目的： 體外藥物敏感性實驗影響因素眾多，包括備篩選藥物的濃度作用時間，接種細胞密度，混雜細胞和加藥物的時間等，通過本研究統(tǒng)一控制體外藥物敏感性實驗的影響因素，使體外藥物敏感性實驗結(jié)果在不同的病人和不同的藥物之間更具有可比性，并分析如何實現(xiàn)藥物的篩選。 材料和方法： 以胰腺癌細胞系Panc-1和ASPC-1為研究對象，利用MTT法檢測健擇、絲裂霉素和5-FU在不同濃度和作用時間下對2株細胞系的抑制率，分析藥物的

8、濃度和時間對藥物抑制率的影響，利用正交分析方法分析其他因素對實驗結(jié)果的影響，為統(tǒng)一制定體外實驗的標準提高藥物之間的可比性提供科學(xué)依據(jù)。 結(jié)果： 健擇對Panc-1和ASPC-1的生長抑制率隨著藥物濃度的增加而升高，5-FU對2株細胞系的殺傷是時間依賴性的，絲裂霉素對2者殺傷受時間和濃度雙重影響。加藥時刻、接種細胞密度及細胞純度對實驗結(jié)果均有較大的影響(p＜0.05)。 結(jié)論： 經(jīng)MTT法測定的細胞抑制率受

9、較多因素的影響，通過MTT測定的抑制率評價藥物的敏感性必須控制影響因素在一定的范圍內(nèi)。 第三部分 體外藥物敏感性實驗篩選化療藥物的療效評價 目的： 目前認為胰腺癌常用的和有效率最高的化療藥物是健擇，通過化療藥物敏感實驗對常用的化療藥物對健擇、絲裂霉素和5-FU進行篩選，當(dāng)篩選出的化療方案和傳統(tǒng)方案不同時，比較篩選出的化療方案是否優(yōu)于經(jīng)驗用藥，評價體外藥物敏感實驗的價值。 方法： 利用MTT

10、法測定各種藥物對不同胰腺癌細胞系和胰腺原代細胞的抗腫瘤作用(IC50)，利用IC50/PPC對藥物的敏感性進行排序，體外篩選出最敏感化療藥物，然后接種至裸鼠體內(nèi)，評價體外藥敏實驗組和傳統(tǒng)化療組的療效。 結(jié)果： 通過藥物篩選的結(jié)果顯示有6例原代細胞和ASPC-1篩選出最敏感藥物是5-FU，3例最敏感藥物為MMC，其余為健擇。10種接種至裸鼠后分三組進行，采用藥物篩選的化療藥物進行治療的療效優(yōu)于單用健擇的方案(p=0.034

11、)。 結(jié)論： 利用化療藥物敏感實驗進行藥物篩選選擇的化療方案優(yōu)于傳統(tǒng)的化療方案。 第四部分 PCDGFshRNA增強胰腺癌細胞系Panc-1對健擇敏感性的研究 目的： 胰腺癌是惡性程度非常高的惡性疾病，手術(shù)切除率低，以健擇為主的化療方案在胰腺癌的研究中正在興起，本文通過轉(zhuǎn)染PCDGFshRNA至胰腺癌細胞系Panc-1，觀察對健擇敏感性的變化，分析PCDGF因子對化療藥物敏感性的影響。

12、 材料和方法： 免疫組化和定量PCR測定PCDGF在胰腺癌組織中的表達，構(gòu)建含2條shRNA的RNAi質(zhì)粒，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染PCDGFshRNA至胰腺癌細胞系Panc-1，測定轉(zhuǎn)染前后細胞對健擇敏感性的變化。 結(jié)果： PCDGF表達于多數(shù)胰腺癌細胞的細胞漿中，定量PCR結(jié)果顯示胰腺癌組織PCDGF的表達明顯高于胰腺囊腺瘤和胰腺炎(t=11.41，p＜0.05)，構(gòu)建PCDGFshRNA質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后PCDGF的

13、表達顯著受到抑制(抑制率為82.3％)，在較高濃度時，健擇的細胞毒作用明顯增強。 結(jié)論： 針對PCDGF的shRNA能顯著增加胰腺癌細胞系Panc-1對健擇的敏感性。 小結(jié) 本研究通過對體外藥物敏感性實驗影響因素的分析旨在盡可能統(tǒng)一實驗過程中的可控性因素，使實驗結(jié)果更具有可比性，探討體外藥物敏感性實驗對化療的指導(dǎo)價值，為實現(xiàn)個體化化療提高胰腺癌化療療效提供科學(xué)依據(jù)，此外采用RNAi技術(shù)增強化療藥物的敏感性

14、，綜合提高胰腺癌的化療療效。通過本實驗我們得到以下結(jié)論和創(chuàng)新點： 1.膠原酶消化法可以快速獲得大量胰腺癌細胞團，采用反復(fù)貼壁法和細胞刮除等方法可以得到較為純化的胰腺癌原代細胞； 2.胰腺癌體外藥物敏感性實驗的實驗結(jié)果受多個實驗條件的影響，如：細胞純度、接種時間、藥物接觸濃度和時間以及接種細胞密度等，控制條件測定IC50/PPC可以較為滿意的評價藥物之間的敏感性； 3.通過體外藥物敏感性實驗進行化療藥物的篩選，采取

15、個體化的化療方案能提高化療的療效； 4.生長因子是當(dāng)前增強化療藥物敏感性的新興位點，PCDGF一方面阻斷IGFR途徑，同時還可以影響TGF、FGF、VEGF等的表達，因此PCDGF可以作為化療增敏的位點，RNA技術(shù)可以穩(wěn)定的抑制PCDGF的表達，針對PCDGF的ShRNA可以顯著增強健擇對胰腺癌的抑制生長作用。 5.本研究在目前國內(nèi)體外藥物敏感性研究的基礎(chǔ)上，提出要統(tǒng)一實驗條件，采用IC50/PPC作為評價指標，將使體外