胰腺癌吉西他濱耐藥基因的篩選及Emodin增強(qiáng)吉西他濱治療胰腺癌的研究.pdf

1、1．研究背景與目的： 胰腺癌(Pancreaticcancer)以早期發(fā)現(xiàn)困難，病情發(fā)展迅速為特征而成為預(yù)后極差的消化道惡性腫瘤之一。手術(shù)切除是唯一根治的手段。但是，多數(shù)患者就診時(shí)已屬晚期，只有10％～15％的患者有手術(shù)切除機(jī)會(huì)；手術(shù)切除的病人術(shù)后也多發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，故此胰腺癌的預(yù)后極差，總體5年生存率低于5％，確診后平均生存時(shí)間不超過(guò)6個(gè)月?；熓且认侔┲匾妮o助治療手段，對(duì)于改善病人生存質(zhì)量，延長(zhǎng)生存期有一定作用。目前，吉西

2、他濱是胰腺癌化療的一線藥物，但總體有效率低于20％。主要問(wèn)題在于多數(shù)胰腺癌病人對(duì)吉西他濱產(chǎn)生耐藥。因此尋找胰腺癌吉西他濱耐藥基因和增加吉西他濱的療效是臨床急需要解決的問(wèn)題。 Emodin是從自然植物中提取的一種活性物質(zhì)，具有抗炎，抗腫瘤及抗菌作用，同時(shí)，Emodin是酪氨酸激酶Ⅱ的抑制劑。 我們采用Affymetrix公司的HGU133A2.0芯片檢測(cè)未經(jīng)處理的胰腺癌吉西他濱耐藥細(xì)胞株(Panc-1)和非耐藥細(xì)胞株(Bx

3、pc-3)基因表達(dá)譜的變化，篩選鑒定出胰腺癌吉西他濱耐藥基因，通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)探討了Emodin增強(qiáng)吉西他濱對(duì)胰腺癌細(xì)胞株生物學(xué)行為的作用，并進(jìn)一步分析Emodin增強(qiáng)吉西他濱治療胰腺癌的作用機(jī)制。 2．材料和方法： 2.1．采用Affymetrix公司的HGU133A2.0寡核苷酸基因芯片，檢測(cè)胰腺癌吉西他濱耐藥細(xì)胞株(Panc-1)和非耐藥細(xì)胞株(Bxpc-3)基因表達(dá)譜，篩選出胰腺癌吉西他濱耐藥基因．并利用熒光定量P

4、CR對(duì)選擇的芯片結(jié)果中差異表達(dá)的基因進(jìn)一步驗(yàn)證． 2.2．采用MTT試驗(yàn)調(diào)查不同濃度Emodin和吉西他濱在不同時(shí)間對(duì)胰腺癌細(xì)胞活力的影響，初步確定下一步實(shí)驗(yàn)濃度。MTT方法檢測(cè)Emodin和吉西他濱聯(lián)合作用48h對(duì)胰腺癌細(xì)胞活力的影響。 2.3．采用流式細(xì)胞術(shù)，caspase3酶活性試驗(yàn)及檢測(cè)PARP的剪切來(lái)觀察Emodin和吉西他濱及聯(lián)合用藥對(duì)胰腺癌細(xì)胞凋亡的影響。 2.4．對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的Bxpc-3細(xì)胞每只0

5、.1ml(7×106)接種于4-6周齡20g雄性BALB/Cnu/nu裸小鼠背部皮下，制成胰腺癌種植瘤模型，待腫瘤全部長(zhǎng)出后隨機(jī)分為4組，分別給予生理鹽水，Emodin(40mg/kg)，吉西他濱(125mg/kg)，及兩藥聯(lián)合，每周二次腹腔注射，連續(xù)2周。每周測(cè)2次腫瘤大小及動(dòng)物體重，研究Emodin在體內(nèi)增強(qiáng)吉西他濱治療胰腺癌作用。 2.5．分別采用缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)和免疫組織化學(xué)檢測(cè)Emodin在體內(nèi)增強(qiáng)吉西他濱

6、誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞增殖。 2.6．采用RT—PCR、qRT—PCR和Westernblot方法探討Emodin對(duì)選擇的胰腺癌吉西他濱耐藥基因的影響。分析Emodin增強(qiáng)吉西他濱治療胰腺癌的作用機(jī)制。 2.7．統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：數(shù)據(jù)表達(dá)為(x)±SE，進(jìn)行雙側(cè)t檢驗(yàn)或單因素方差分析(ANOVA，LSD多重比較)，P＜0.05視為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。統(tǒng)計(jì)由SPSS13.0統(tǒng)計(jì)包完成。 3．結(jié)果： 3.1鑒定胰

7、腺癌吉西他濱耐藥相關(guān)基因采用HGU133A2.0寡核苷酸基因芯片檢測(cè)兩細(xì)胞株基因表達(dá)譜，鑒定相互2887各表達(dá)有差異的基因。與非耐藥細(xì)胞株(Bxpc-3)比較，耐藥細(xì)胞株(Panc-1)5倍及5倍以上差異基因有141個(gè)。高表達(dá)基因和低表達(dá)基因分別有103個(gè)和38個(gè)。 3.2qRT—PCR驗(yàn)證基因芯片結(jié)果為了驗(yàn)證基因芯片結(jié)果，應(yīng)用qRT—PCR檢測(cè)兩種細(xì)胞中22個(gè)耐藥細(xì)胞株(Panc-1)5倍以上過(guò)表達(dá)的基因。結(jié)果顯示21個(gè)基因兩

8、種方法所得基因表達(dá)倍數(shù)大致相當(dāng)。 3.3Emodin在體外增加吉西他濱對(duì)胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制為了探討Emodin對(duì)胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，應(yīng)用MTT方法檢測(cè)不同濃度的Emodin(0-160μM)作用于胰腺癌細(xì)胞24h、48h和72h的效應(yīng)．結(jié)果顯示隨著Emodin濃度和作用時(shí)間的增加，細(xì)胞活力呈下降趨勢(shì)。隨后的實(shí)驗(yàn)揭示，和單用藥比較，給予48小時(shí)Emodin(Bxpc-3和MiaPaca-2,40μM；Panc-1，80μM)在

9、體外可顯著增強(qiáng)吉西他濱(Panc-1和MiaPaca-2，5μg/ml；Bxpc-3，0.5μg/ml)抑制胰腺癌細(xì)胞的活力(P＜0.05)。 3.4Emodin在體外增加吉西他濱誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡胰腺癌細(xì)胞接受Emodin(Bxpc-3，40μM；Panc-1，80μM)、吉西他濱(Panc-1，5μg/ml；Bxpc-3，0.5μg/ml)和聯(lián)合處理24h后，流式細(xì)胞術(shù)顯示聯(lián)合治療引起凋亡細(xì)胞比例顯著增多(P＜0.05，)，

10、聯(lián)合治療后Caspase3酶活性及PARP剪切片斷增加，提示Emodin能夠增加吉西他濱誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。 3.5Emodin在體內(nèi)增加吉西他濱對(duì)胰腺癌種植瘤生長(zhǎng)的抑制治療結(jié)束后，聯(lián)合治療組的腫瘤體積顯著小于對(duì)照組和吉西他濱組(P＜0.05)，而所有動(dòng)物無(wú)死亡，各組間的體重在治療期間無(wú)顯著差異，肝腎功能無(wú)差異，顯示良好的耐受性。與對(duì)照組和單用藥比較，聯(lián)合治療可以明顯提高胰腺癌細(xì)胞的凋亡，并降低增殖基因Ki-67的表達(dá)(P＜0.05

11、)。 3.6Emodin在體外增加吉西他濱療效的機(jī)制采用RT—PCR、qRT—PCR．和Westernblot方法發(fā)現(xiàn)吉西他濱可以上調(diào)survivin的表達(dá)，而Emodin通過(guò)下調(diào)胰腺癌細(xì)胞吉西他濱耐藥相關(guān)基因HS3ST1，AKRC13和survivin，達(dá)到增強(qiáng)吉西他濱療效的作用。 4．結(jié)論 4.1利用基因芯片技術(shù)，篩選出了一些顯著的胰腺癌吉西他濱耐藥基因4.2Emodin在體外對(duì)胰腺癌細(xì)胞有明顯的誘導(dǎo)凋亡及抑