ERK通路參與調(diào)節(jié)MDR-1、RRM1基因表達(dá)介導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞吉西他濱化療抵抗.pdf

1、背景:胰腺癌的發(fā)病率逐年上升，由于其早期臨床癥狀不明顯，80﹪患者確診時(shí)屬于晚期，而化療是晚期胰腺癌的主要治療手段。 目前吉西他濱單藥是晚期胰腺癌的標(biāo)準(zhǔn)的一線化療方案，但其中位生存期僅5.4-5.6個(gè)月，1年生存率僅為16﹪-19﹪，療效較差。 胰腺癌化療失敗的豐要原因之一是胰腺癌細(xì)胞的多藥耐藥，多藥耐藥是指腫瘤細(xì)胞接觸某一種抗癌藥物的同時(shí)，對其他結(jié)構(gòu)和功能不同的藥物產(chǎn)生耐藥。吉西他濱化療失敗的原因也是胰腺癌細(xì)胞在化療過

2、程中產(chǎn)生了耐藥現(xiàn)象，作為胰腺癌化療的一線用藥，探討其耐藥機(jī)制顯的十分重要。 細(xì)胞膜糖蛋白p-gp是多藥耐藥基因mdr-1的表達(dá)產(chǎn)物。P-gp為一能量依賴的單向藥物外排泵，可將進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的藥物排出細(xì)胞外，由此引起的細(xì)胞內(nèi)藥物積聚減少是MDR的主要原因。多數(shù)腫瘤細(xì)胞膜上可檢測到p-gp的過度表達(dá)，在正常胰腺細(xì)胞中檢測到p-gp的表達(dá)為33﹪，而胰腺癌細(xì)胞中p-gp的表達(dá)高至71﹪，因此胰腺癌被認(rèn)為是天然耐藥的腫瘤之一。要潔等研究表明

3、胰腺癌耐吉西他濱細(xì)胞株中mdr-1的表達(dá)較其親本細(xì)胞升高。 吉西他濱是細(xì)胞周期特異性抗代謝藥物，它在體內(nèi)由脫氧胞苷激酶(dCK酶)代謝為其活性產(chǎn)物---吉西他濱二磷酸鹽(dFdCDP)和吉西他濱三磷酸鹽(dFdCTP)，從而發(fā)揮抗腫瘤作用的。RR有兩個(gè)亞基組成-RRM1和RRM2，其中RRM1是核苷酸結(jié)合位點(diǎn)，控制底物的特異性和整個(gè)酶的活性，同時(shí)也是核昔類似物系的化療藥物的結(jié)合位點(diǎn)。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)吉西他濱作為一種影響因素作用于

4、腫瘤細(xì)胞時(shí)，RRM1表達(dá)水平增高會(huì)使腫瘤細(xì)胞對化療藥的耐藥性增加。近來的幾項(xiàng)研究也表明在耐吉西他濱胰腺癌細(xì)胞中RRMl的表達(dá)升高，可能是導(dǎo)致胰腺癌耐吉西他濱的一個(gè)重要因素。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kirlase MAPK)家族是信號傳導(dǎo)中最主要的成分，可將不同的細(xì)胞外信息轉(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)。細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)是有絲分裂原激活蛋白激酶(MAPK)家族的一個(gè)亞組，可被許多細(xì)胞因子和生長

5、因子激活，介導(dǎo)細(xì)胞增殖，分化等信號傳導(dǎo)。ERK1和ERK2是其中的兩個(gè)重要成員，它們所參與的信號傳導(dǎo)與腫瘤的發(fā)生，發(fā)展有關(guān)。有體外和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明ERK通路的激活不僅與胰腺癌的發(fā)生有關(guān)，并且ERK的過度激活與腫瘤化療的耐藥相關(guān)，其機(jī)制可能是通過上調(diào)腫瘤耐藥相關(guān)基因的表達(dá)。趙玉沛等發(fā)現(xiàn)在胰腺癌耐藥細(xì)胞株中，ERK蛋白明顯升高，并且使用ERK通路阻斷劑后，細(xì)胞的耐藥會(huì)得到部分逆轉(zhuǎn)，因此推測ERK通路可能參與了胰腺癌細(xì)胞耐藥形成。 由以

6、上理論，mdr-1基因編碼的p-gp蛋白可以改變細(xì)胞內(nèi)藥物的分布，而RRMl又是吉西他濱的作用靶點(diǎn)，是吉西他濱特異性結(jié)合位點(diǎn)，ERK通路又可能參與了胰腺癌細(xì)胞的耐吉西他濱的過程，我們設(shè)想是否ERK通路調(diào)節(jié)胰腺癌細(xì)胞耐吉西他濱的形成是通過mdr-1、RRM1的表達(dá)升高而實(shí)現(xiàn)的。理論上來講，此觀點(diǎn)是行的通的，ERK通路參與了胰腺癌耐吉西他濱的過程，而胰腺癌形成耐藥的過程與藥物的分布及代謝情況密切相關(guān)，p-gp與RRM1分別是決定藥物分布與代

7、謝的兩個(gè)重要因素。近來有研究表明ERK通路與mdr-1基因之間可能存在著關(guān)聯(lián)，即ERK通路可能是通過調(diào)節(jié)mdr-1基因而改變化療藥物的敏感性的，但這一實(shí)驗(yàn)是在胃癌細(xì)胞中進(jìn)行的，目前在胰腺癌中尚無相關(guān)報(bào)道。目前國內(nèi)外尚無同樣研究，本實(shí)驗(yàn)初步探討了ERK通路與胰腺癌細(xì)胞耐吉西他濱的機(jī)制之問的內(nèi)在聯(lián)系，并且與臨床實(shí)踐中的難點(diǎn)相結(jié)合的，具有一定的科研及臨床價(jià)值。 目的:通過建立胰腺癌細(xì)胞吉西他濱化療抵抗模型，動(dòng)態(tài)檢測不同藥物濃度下ERK

8、、 mdr-1、RRM1的表達(dá)情況，并分別用ERK通路的激活劑與阻斷劑作用，觀察它們?nèi)叩淖兓厔荩醪教接懸认侔┘?xì)胞吉西他濱化療抵抗的可能機(jī)制。 材料和方法: 1 細(xì)胞和免疫細(xì)胞化學(xué)方法胰腺癌細(xì)胞株由中山大學(xué)動(dòng)物中心提供。將潔凈的載玻片置于6孔培養(yǎng)板，細(xì)胞消化后以一定細(xì)胞數(shù)接種于6孔培養(yǎng)板，置于含5﹪CO<,2>、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。吸去上層培養(yǎng)基，固定細(xì)胞，風(fēng)干。進(jìn)行免疫SP法染色。 2 細(xì)胞培養(yǎng)和

9、藥物處理胰腺癌細(xì)胞株SW1990用含GEM的RPMI1640培養(yǎng)基(含10﹪胎牛血清，GEM在培養(yǎng)基中的終濃度分別為0、30、60、100、150、200nmol/l)，置于含5﹪CO<,2>、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 實(shí)驗(yàn)分組：吉西他濱單藥組(簡稱GEM組)、GEM+U0126組、GEM+EGF組。 3 MTT法檢測各實(shí)驗(yàn)組中胰腺癌細(xì)胞的增殖抑制作用及IC50。 以4X10<'4>個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔培養(yǎng)板上

10、，24小時(shí)后換不同濃度、不同種類藥物的培養(yǎng)基，分別作用24、48、72小時(shí)后酶標(biāo)儀檢測OD492光密度值。 細(xì)胞的相對抑制率(Inhibition rate，IR)由以下公式計(jì)算： IR=(1-藥物組OD值/對照組OD值)×1000﹪ 通過對細(xì)胞的抑制率求出相應(yīng)各組的IC50。 4 統(tǒng)計(jì)分析 免疫組化圖片用image pro-plus軟件進(jìn)行半定量分析(其中ERK灰度值與ERK蛋白表達(dá)成反比關(guān)系)

11、，RT-PCR結(jié)果使用Band凝膠軟件進(jìn)行半定量分析，結(jié)果的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 10.0軟件完成，對相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行線性相關(guān)分析，并對MTT結(jié)果進(jìn)行分析，計(jì)算IC50值。 結(jié)果: 1.建立的GEM化療抵抗胰腺癌細(xì)胞株模型經(jīng)過濃度梯度遞增法誘導(dǎo)的胰腺癌GEM化療抵抗細(xì)胞株，細(xì)胞可以在GEM終濃度為0、30、60、100、150、200nmol/l的培養(yǎng)基中穩(wěn)定生長并傳代，這種方法與臨床化療耐藥的過程十分接近，是一種十分接

12、近臨床腫瘤化療后產(chǎn)生耐藥的方法，對于探討臨床腫瘤化療后耐藥的機(jī)理更有意義。 2.不同GEM濃度化療抵抗的胰腺癌細(xì)胞株中ERK、mdr-1、RRM1基因的表達(dá)隨著GEM濃度的提高，ERK、 mdr-1、RRM1的表達(dá)也同步升高，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，GEM濃度/mdr-1、GEM濃度/RRM1、ERK/mdr-1、ERK/RRM1之間均存在高度相關(guān)性，其相關(guān)系數(shù)分別為0.960、0.966、-0.943、-0.883，并都取得了統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

13、。 3.使用阻斷劑、激活劑后三者的表達(dá)情況0nmol/l濃度的GEM化療抵抗細(xì)胞株，用ERK通路阻斷劑作用于后，細(xì)胞株的ERK灰度值由248.28±11.03上升為283.17±12.45、mdr-l表達(dá)由0.81±0.07下降為0.2±0.01、RRM1的表達(dá)由1.27±0.06下降為0.25±0.02；200nmol/l濃度的GEM化療抵抗細(xì)胞株用ERK通路阻斷劑作用于后，細(xì)胞株的ERK灰度值由164.22±13.17上升為

14、186.85±13.14，mdr-1表達(dá)由1.41±0.04下降為0.23±0.02，RRM1的表達(dá)由1.45±0.18下降為0.21±0.03。而0nmol/l濃度的GEM化療抵抗細(xì)胞株在經(jīng)過EGF作用后，細(xì)胞株的ERK灰度值由248.28±11.03下降為116.35±16.13、mdr-1表達(dá)由0.81±0.07上升為1.22±0.05、RRM1的表達(dá)由1.27±0.06上升為1.35±0.06；200nmol/l濃度的GEM化療

15、抵抗細(xì)胞株在經(jīng)過EGF作用后，細(xì)胞株的ERK灰度值由164.22±13.17下降為106.55±16.45，mdr-1表達(dá)由1.41±0.04上升為1.5±0.07，RRM1的表達(dá)由1.45±0.18上升為1.52±0.12。由于ERK蛋白灰度與表達(dá)成反比，因此由以上數(shù)據(jù)ERK、mdr-1、RRMl三者呈現(xiàn)ERK通路阻斷后同步降低，ERK通路激活后同步升高的趨勢。 4.MTT法測IC50值隨著GEM化療抵抗的濃度由0nmol/l

16、升高到200nmol.l，其IC50值也由4.104增加到10.2，經(jīng)U0126處理后，0nmol/l的IC50值由4.104下降到3.26，200nmol/l的IC50值由10.2下降到4.5。經(jīng)EGF處理后，0nmol/l的IC50值由4.104上升到8.89，200nmol/l的IC50值由10.2上升到17.17。 結(jié)論: 1.mdr-1、RRM1基因的表達(dá)上調(diào)可導(dǎo)致胰腺癌細(xì)胞GEM化療抵抗。 2.ERK