低氧誘導胰腺癌免疫逃避機制及相關信號通路的初步研究.pdf

1、目的：胰腺癌是臨床上常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，手術為其最佳治療方法。然而，手術切除率低，對化療藥物普遍耐藥，復發(fā)率高導致胰腺癌預后極差，尋找新的治療方法成為目前研究的熱點。本實驗首先驗證胰腺癌腫瘤內(nèi)的低氧微環(huán)境及其與MIC表達的相關性，接著在體外細胞學實驗中構建低氧模型并研究低氧環(huán)境中胰腺癌細胞的免疫逃逸機制。同時我們在細胞學實驗中和裸鼠成瘤模型中通過直接激活NO-cGMP-PKG信號通路來研究其對低氧誘導下胰腺癌細胞逃避自然殺傷作用的逆

2、轉效果，為臨床上應用激活NO-cGMP-PKG信號通路的手段促進先天性免疫系統(tǒng)抑制胰腺癌的發(fā)展提供理論上的依據(jù)和新的線索。
　　 方法：第一部分：收集湘雅醫(yī)院2002年1月至2008年5月手術切除的胰腺癌組織標本42例，慢性胰腺炎組織標本9例，8例正常胰腺組織來自移植中心提供或尸檢。免疫組織化學法檢測HIF-1α和MIC在胰腺癌標本、慢性胰腺炎標本和正常胰腺標本中的表達情況，分析兩者之間的相關性。第二部分：構建低氧培養(yǎng)模型，體外

3、常氧及低氧條件下培養(yǎng)胰腺癌PANC-1細胞，免疫細胞化學法和免疫熒光細胞化學法檢測細胞膜上MIC的表達，逆轉錄多聚酶鏈反應檢測PANC-1細胞中MIC A和MIC B的mRNA表達變化。分選、純化、擴增人外周血NK細胞，酶聯(lián)免疫吸附法檢測不同氧濃度及NO-cGMP-PKG信號通路激活或抑制時對PANC-1細胞培養(yǎng)基中可溶性MIC A和可溶性MIC B的表達影響，同時流式細胞儀檢測PANC-1細胞膜上的MIC表達和PANC-1培養(yǎng)基與自然

4、殺傷細胞共培養(yǎng)后NK細胞表面NKG2D的表達。MTT法檢測不同靶效比時NK細胞對不同氧濃度培養(yǎng)及NO-cGMP-PKG信號通路激活或抑制時PANC-1細胞的殺傷活性。第三部分：PANC-1細胞裸鼠皮下成瘤，隨機分成治療組與安慰劑組，硝酸甘油為治療藥物。免疫組織化學法檢測兩組腫瘤標本中HIF-1α和MIC的表達。逆轉錄多聚酶鏈反應檢測兩組腫瘤標本中中MIC A和MIC B mRNA表達變化。蛋白印記法檢測兩組腫瘤標本中的MIC表達差異。酶

5、聯(lián)免疫吸附法檢測兩組成瘤裸鼠及正常裸鼠血清中的可溶性MIC A及可溶性MIC B差異。流式細胞儀檢測兩組成瘤裸鼠及正常裸鼠血液中NK細胞上NKG2D的表達差異。
　　 結果：1.免疫組化示胰腺癌組織中HIF-1α蛋白和MIC蛋白陽性率分別為為32/42(76.2％)、38/42(90.5％)，明顯高于慢性胰腺炎組織2/9(22.2％)、2/9(22.2％)和正常胰腺組織0/8(0％)、1/8(12.5％)(P<0.001)。Ⅰ-

6、Ⅱ期標本中，HIF-1α陽性表達率為57.1％，低于Ⅲ-Ⅳ期標本中的92.9％(P<0.05)。有淋巴結轉移的胰腺癌組織HIF-1α蛋白陽性表達率為91.3％，高于無淋巴結轉移的57.9％(P<0.05)。在不同病理分級和臨床分期的標本中，MIC蛋白的表達高低也有顯著差異(P<0.05)。MIC蛋白和HIF-1α蛋白表達呈負相關(r=-0.522，P<0.001)。2.經(jīng)MACS免疫磁珠分選后(CD3-CD56+)NK細胞含量由分選前的

7、13.8±2.6％提高到92.1±3.7％，IL-2擴增后滿足實驗要求。三氣培養(yǎng)箱成功構建了低氧培養(yǎng)環(huán)境。RT-PCR示低氧組和常氧組PANC-1細胞的MIC A的mRNA水平分別為0.514±0.104、0.540±0.125，MIC B的mRNA水平分別為0.663±0.189、0.697±0.176，兩組無統(tǒng)計學顯著差異(P>0.05)。FACS示NO-cGMP-PKG信號通路激活劑會上調低氧組PANC-1細胞膜上的MIC的表達率

8、及NK細胞的NKG2D表達率；ELISA法顯示激活劑還能主要減少可溶性MICA的產(chǎn)生；MTT法則表明激活劑能增強PANC-1細胞對NK細胞的敏感性。抑制劑則起相反作用。3.GTN對PANC-1細胞皮下成瘤有較明顯抑制作用，治療28天后安慰劑組和治療組的瘤體大小分別為1550.4±148.6 mm3和750.6±71.2mm3，平均抑制率達到51.59％。免疫組化顯示，治療組HIF-1α蛋白表達低于安慰劑組，MIC蛋白表達高于于安慰劑組(

9、P<0.05)。RT-PCR和Western Blot分別定量檢測瘤體中MIC基因和蛋白的水平。結果示MICA和MIC B基因在兩組瘤體中均表達，治療組瘤體中MIC A的mRNA的表達水平為0.748±0.112，MIC B的mRNA的表達水平為0.321±0.131。安慰劑組瘤體中MIC A的mRNA的表達水平為0.702±0.157，MIC B的mRNA的表達水平為0.298±0.173，兩組無顯著差異(P>0.05)。治療組瘤體中

10、MIC蛋白的表達水平為0.688±0.214，安慰劑組瘤體中MIC蛋白的表達水平為0.363±0.123，治療組顯著高于安慰劑組(P<0.01)。同時ELISA法示正常裸鼠的sMIC A和sMIC B水平分別為15.2±21.4pg/ml和0±10.2 pg/ml，治療組sMICA和sMICB水平分別為345.1±125.2pg/ml和52.8±25.2 pg/ml，安慰劑組裸鼠血清中的sMICA和sMICB水平分別為674.2±205

11、.4pg/ml和144.4±61.8pg/ml，治療組低于安慰劑組，高于正常裸鼠，有顯著差異(P<0.001)。FACS示正常組裸鼠血液中的NKG2D表達率為68.51±19.42％，治療組裸鼠血液中的NKG2D的表達率為60.52±10.52％，安慰劑組裸鼠血液中的NKG2D的表達率為39.88±10.14％，正常組高于治療組(P=0.002)，治療組和正常組的NKG2D的表達率均高于安慰劑組(P<0.001)。NKG2D的表達率與s

12、MIC的表達水平之間呈負相關(r=-0.905，P<0.001)。
　　 結論：胰腺癌組織中的HIF-1α表達率和表達水平顯著高于慢性胰腺炎和正常胰腺組織，反映胰腺癌組織中存在缺氧微環(huán)境，而HIF-1α和MIC在胰腺癌中的表達呈負相關提示低氧與腫瘤免疫逃逸有關。細胞學實驗證明，其機制在于胰腺癌細胞膜上大量MIC脫落形成sMIC，sMIC封閉NK細胞上的NKG2D受體，降低NK細胞的殺傷活性。NO-cGMP-PKG信號通路與低氧誘