大黃素抗胰腺癌作用及機(jī)制研究.pdf

1、胰腺癌是胰腺的外分泌腺癌，為臨床上常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤。胰腺癌發(fā)病率約占全部惡性腫瘤的1％～7％，但是近年來(lái)在全球范圍內(nèi)，其發(fā)病率呈明顯增加趨勢(shì)。本文對(duì)大黃素抗胰腺癌的作用及其機(jī)制進(jìn)行了研究，將為大黃素聯(lián)合吉西他濱治療胰腺癌的臨床應(yīng)用提供客觀而科學(xué)的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為胰腺癌的臨床治療提供一種新的有效藥物。本研究分為三個(gè)部分：
　　 第一部分：大黃素對(duì)人胰腺癌細(xì)胞株SW1990的生物學(xué)效應(yīng)及其作用機(jī)制。
　　 目的

2、：⑴觀察大黃素對(duì)人胰腺癌細(xì)胞株SW1990的生物學(xué)效應(yīng)；⑵探討大黃素誘導(dǎo)人胰腺癌SW1990凋亡的作用機(jī)制。
　　 方法：①在體外，將人胰腺癌SW1990細(xì)胞暴露于不同濃度的大黃素(10μM、20μM、40μM、80μM)中，觀察大黃素對(duì)人胰腺癌SW1990細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響，以CCK-8法檢測(cè)大黃素、及大黃素聯(lián)合吉西他濱對(duì)SW1990細(xì)胞增殖的影響，以流式細(xì)胞術(shù)觀察大黃素、及大黃素聯(lián)合吉西他濱對(duì)SW1990細(xì)胞凋亡的影響；②在體

3、外，以EMSA法檢測(cè)大黃素、吉西他濱分別單獨(dú)及聯(lián)合作用SW1990細(xì)胞48小時(shí)后NF-κB轉(zhuǎn)錄活性表達(dá)的影響，并以Western Blot法檢測(cè)SW1990細(xì)胞中凋亡蛋白Bcl-2、Bax、Survivin、Pro-Caspase3、8、9的變化情況，以進(jìn)一步明確大黃素誘導(dǎo)人胰腺癌SW1990細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。
　　 結(jié)果：⑴在體外，大黃素能顯著抑制人胰腺癌細(xì)胞增殖，不同濃度大黃素(10μM、20μM、40μM、80μM)作用

4、SW1990細(xì)胞24 h后細(xì)胞存活率分別為85％、80％、65％和56％，呈明顯濃度依賴性(*P<0.05)；40μM大黃素處理12 h、24 h、48 h和72 h后，SW1990細(xì)胞存活率分別為88％、67％、47％和35％，呈時(shí)間依賴性(*P<0.05)；大黃素(40μM)聯(lián)合吉西他濱(20μM)作用72 h后細(xì)胞存活率僅為22.62％，相對(duì)吉西他濱組(30.78％)有顯著差異(*P<0.05)；大黃素作用后的SW1990細(xì)胞呈現(xiàn)

5、細(xì)胞凋亡的典型表現(xiàn)，Annexin V聯(lián)合PI法染色結(jié)果進(jìn)一步明確了大黃素的促凋亡作用，且該作用具有藥物劑量依賴性；⑵大黃素(40μM)、吉西他濱(20μM)分別單獨(dú)或聯(lián)合用藥作用于SW1990細(xì)胞48 h后，與對(duì)照組相比較，大黃素單藥或聯(lián)合吉西他濱可顯著抑制NF-κB活性在胰腺癌SW1990細(xì)胞中的表達(dá)，而吉西他濱治療組可明顯上調(diào)NF-κB活性在胰腺癌SW1990細(xì)胞中的表達(dá)；大黃素(40μM)，吉西他濱(20μM)分別單獨(dú)或聯(lián)合用藥

6、作用于SW1990細(xì)胞48 h后，大黃素或聯(lián)合吉西他濱可以明顯抑制Bcl-2、Survivin的表達(dá)，但可以顯著上調(diào)Bax的表達(dá)，從而也降低了Bcl-2/Bax的比值，且能明顯抑制Pro-caspase3、8、9的表達(dá)。
　　 第二部分：大黃素對(duì)胰腺癌裸鼠SW1990細(xì)胞移植瘤的抑瘤作用及機(jī)制。
　　 目的：探討大黃素是否能增強(qiáng)吉西他濱對(duì)裸鼠SW1990細(xì)胞移植瘤的抑瘤作用及其可能的機(jī)制。
　　 方法：48只裸鼠

7、接種SW1990胰腺癌細(xì)胞，三周后，待所有的裸鼠種植瘤長(zhǎng)徑均達(dá)≥5mm后將荷瘤鼠用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)分成4個(gè)組，每組12只：生理鹽水組(N組)，大黃素組(E組：40 mg/kg)，吉西他濱組(G組：125 mg/kg)，聯(lián)合用藥組(E+G組：大黃素40 mg/kg+吉西他濱80 mg/kg)。各組均采取腹腔注射藥物，三天一次，前后共11次。觀察各組用藥過(guò)程中腫瘤體積的變化，末次用藥后一周進(jìn)行活體熒光顯像檢測(cè)腫瘤變化，處死裸鼠后取腫瘤組織測(cè)出體

8、積后存放于液氮中，采用透射電鏡觀察腫瘤組織線粒體的變化；采用Tunel法檢測(cè)各組腫瘤組織凋亡情況；采用免疫組織化學(xué)染色法和Western Blot法檢測(cè)腫瘤組織Bax、Bcl-2、ActiveCaspase-9、Active Caspase-3、NF-κB(p65)和p-Akt的表達(dá)水平以及CytochromeC的釋放情況；通過(guò)凝膠電泳遷移分析(EMSA)檢測(cè)NF-κB與DNA結(jié)合活性的改變。
　　 結(jié)果：末次用藥后一周E+G組

9、腫瘤體積明顯小于其他各組?；铙w熒光顯像顯示與對(duì)照組相比，大黃素治療組腫瘤的個(gè)數(shù)減少，體積減小，聯(lián)合組治療效果更明顯。腫瘤組織細(xì)胞透射電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察所見(jiàn)，N組線粒體常見(jiàn)，形態(tài)較規(guī)則，結(jié)構(gòu)良好，基質(zhì)均勻，線粒體嵴完整；E組部分細(xì)胞線粒體腫脹，大小不一致，基質(zhì)不均，線粒體嵴較對(duì)照組和G組稀少，部分嵴有斷裂；G組細(xì)胞線粒體較E組完整，可見(jiàn)某些線粒體腫脹，基質(zhì)不均，嵴發(fā)育不良；E+G組線粒體大小不一，分布不均，基質(zhì)不均勻，線粒體嵴發(fā)育不良且分布

10、不均，并可見(jiàn)線粒體膜破裂。Tunel法顯示E+G組腫瘤細(xì)胞凋亡比其余各組顯著增多。
　　 第三部分：大黃素對(duì)胰腺癌轉(zhuǎn)移及血管生成的影響及機(jī)制。
　　 目的：⑴觀察大黃素對(duì)胰腺癌轉(zhuǎn)移的影響；⑵觀察大黃素對(duì)胰腺癌血管生成的影響；⑶探討大黃素對(duì)胰腺癌轉(zhuǎn)移、血管生成的影響機(jī)制。
　　 方法：采用細(xì)胞劃痕試驗(yàn)研究不同濃度大黃素(10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L)對(duì)胰腺癌SW1990細(xì)胞遷移的影響。采用T

11、ranswell侵襲實(shí)驗(yàn)研究不同濃度大黃素對(duì)SW1990細(xì)胞侵襲能力的影響。在培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)的基礎(chǔ)上，通過(guò)體內(nèi)Matrigel plug法血管抑制實(shí)驗(yàn)研究大黃素對(duì)體內(nèi)血管生成的影響。制作裸鼠胰腺癌原位移植模型，將裸鼠隨機(jī)分為四組，術(shù)后第3周開(kāi)始給藥，對(duì)照組每只腹腔注射生理鹽水0.2 mL；吉西他濱(100 mg/kg)腹腔注射；大黃素(50 mg/kg)灌胃；聯(lián)合組為吉西他濱(80 mg/kg)腹腔注射聯(lián)合大黃素(50 mg

12、/kg)灌胃。各組均為每周給藥3次，共治療兩周。用藥后4周末應(yīng)用MicroPET對(duì)裸鼠進(jìn)行掃描，處死裸鼠后測(cè)定瘤體重量，留取胰腺腫瘤、腸、肝臟、腹壁和腎，標(biāo)本連續(xù)切片，HE染色，確定轉(zhuǎn)移范圍。通過(guò)腫瘤血管成像研究大黃素對(duì)胰腺癌血管生成的影響。免疫組化法檢測(cè)大黃素、吉西他濱和大黃素聯(lián)合吉西他濱對(duì)原位移植瘤組織中微血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物CD31、CD34和血管生成相關(guān)因子(VEGF、MMP-2、MMP-9和Survivin)的影響。Wester

13、n Blot法檢測(cè)大黃素、吉西他濱和大黃素聯(lián)合吉西他濱對(duì)原位移植瘤組織中血管生成相關(guān)基因(NF-κB及其調(diào)控因子VEGF、MMP-2、MMP-9、eNOS和Survivin)表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果：細(xì)胞劃痕試驗(yàn)顯示大黃素組(10μmol/L、20μmol/L和40μmol/L)抑制胰腺癌細(xì)胞遷移，呈濃度依賴性，與對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P<0.05)；Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)顯示大黃素可抑制體外胰腺癌SW1990細(xì)

14、胞侵襲，呈濃度依賴性，與對(duì)照組相比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)(*P<0.05)；體內(nèi)Matrigel plug法血管抑制實(shí)驗(yàn)顯示：相對(duì)于EPCs組，大黃素+EPCs組顯著降低Matrigel膠中血紅蛋白含量，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P<0.05)。裸鼠原位移植瘤MicroPET掃描結(jié)果表明：吉西他濱和大黃素組的腫瘤/肌肉感興趣區(qū)的比值(ROI)較對(duì)照組均有顯著性差異(*P<0.05)，聯(lián)合組(1.55±0.058)較其他各組均有顯著性差異(**P

15、<0.05)；吉西他濱組和大黃素組的腫瘤標(biāo)準(zhǔn)攝取值(SUV)較對(duì)照組均有顯著性差異(*P<0.05)，聯(lián)合組較其他各組均有顯著性差異(**P<0.05)；與對(duì)照組相比，大黃素組和吉西他濱組均可明顯抑制胰腺原發(fā)腫瘤生長(zhǎng)(*P<0.05)；另外，與對(duì)照組和各單藥組相比較，大黃素和吉西他濱聯(lián)合組可顯著抑制胰腺原發(fā)腫瘤生長(zhǎng)(**P<0.05)。
　　 結(jié)論：①大黃素對(duì)胰腺癌SW1990細(xì)胞的增殖具明顯抑制作用，且有劑量和時(shí)間依賴性，能明

16、顯誘導(dǎo)胰腺癌SW1990細(xì)胞凋亡；大黃素聯(lián)合吉西他濱聯(lián)合作用時(shí)可具有協(xié)同增殖抑制和促凋亡作用。②大黃素可顯著抑制SW1990細(xì)胞中NF-κB活性及其下游蛋白Bcl-2、Survivin的表達(dá)，并上調(diào)Bax蛋白，降低Bcl-2/Bax比值，下調(diào)Pro-caspase3、8、9的表達(dá)，啟動(dòng)線粒體凋亡途徑，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。③大黃素能顯著增強(qiáng)吉西他濱對(duì)裸鼠胰腺癌SW1990細(xì)胞移植瘤的抑瘤效果，其機(jī)制可能是大黃素通過(guò)抑制胰腺癌組織中A

17、kt和NF-κB的激活，抑制Bcl-2的表達(dá)，并促進(jìn)Bax的表達(dá)，從而降低Bcl-2/Bax的比值，破壞腫瘤細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)及增加線粒體膜通透性，引起線粒體Cytochrome C釋放，通過(guò)觸發(fā)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)促使Caspase-9、Caspase-3激活，最終導(dǎo)致其增強(qiáng)吉西他濱對(duì)胰腺癌移植瘤的促凋亡作用。④大黃素可通過(guò)抑制胰腺癌血管生成而抑制胰腺癌的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移。⑤大黃素抑制胰腺癌血管生成，其機(jī)制可能與下調(diào)胰腺癌中NF-κB及其調(diào)控