Bit1蛋白對胰腺癌惡性表型調(diào)控作用及機制研究.pdf

1、胰腺癌是惡性程度最高的腫瘤之一，其發(fā)病隱匿、進(jìn)展迅速、手術(shù)切除率低、放化療效果不佳，預(yù)后極差，總體5年生存率不到5％，在全球癌癥發(fā)病率中占第13位，排在所有惡性腫瘤致死原因的第四位。大多數(shù)的胰腺癌患者往往確診時已出現(xiàn)淋巴或血運轉(zhuǎn)移，從而失去了根治性手術(shù)治療的機會。胰腺癌患者死亡的主要原因是腫瘤早期即發(fā)生局部侵襲或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，也是制約患者預(yù)后的主要因素。目前胰腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移機制尚不明確，了解胰腺癌的惡性生物學(xué)行為發(fā)生機制，并給予適當(dāng)?shù)母深A(yù)措

2、施，對于提高胰腺癌的臨床診治水平并改善患者的預(yù)后具有十分重要的現(xiàn)實意義。同時篩選最佳的預(yù)后標(biāo)志物，對于臨床醫(yī)師選擇恰當(dāng)?shù)闹委煼桨?，避免不必要的治療帶來的毒副作用，具有一定的臨床指導(dǎo)意義。
　　Bit1(Bcl-2 inhibitor of transcription1)是2004年發(fā)現(xiàn)的一個與細(xì)胞失巢凋亡相關(guān)的蛋白質(zhì)，其正常定位于線粒體內(nèi)膜，目前其確切生理功能尚未完全清楚。初期研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)失偶聯(lián)即受到失黏附信號刺激時

3、，Bit1蛋白從線粒體內(nèi)膜轉(zhuǎn)移至細(xì)胞胞漿中，拮抗胞質(zhì)中的TLE1蛋白，并通過與胞漿中的轉(zhuǎn)錄共調(diào)解因子AES(amino-terminal enhancer of split)蛋白結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)復(fù)合物，啟動一種特殊的凋亡形式，即非caspase（半胱氨酸蛋白酶）途徑依賴的凋亡。目前研究認(rèn)為腫瘤細(xì)胞的失巢凋亡抵抗與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移及耐藥密切相關(guān)，其中腫瘤細(xì)胞的EMT(Epithelial-MesenchymalTransition)過程

4、在其中起著至關(guān)重要的作用。鑒于胰腺癌細(xì)胞的高侵襲性及轉(zhuǎn)移能力強的特點，了解Bit1蛋白與胰腺癌細(xì)胞失巢凋亡的相關(guān)性及對侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響，并探討其對胰腺癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的作用機制，對于加深我們對胰腺癌分子機理的認(rèn)識及尋找新的診斷或治療靶點具有十分重要的意義。
　　目的:
　　1.觀察Bit1蛋白在六株胰腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況及對胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力的影響。
　　2.探索Bit1蛋白對胰腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的

5、影響機制。
　　3.探討B(tài)it1蛋白在胰腺癌病人組織中的表達(dá)情況以及與胰腺癌病人臨床病理特征的相關(guān)性及對預(yù)后的影響。
　　方法:
　　1.Western blot及Quantitative Real-time PCR技術(shù)檢測六株胰腺癌細(xì)胞株中Bit1的基礎(chǔ)表達(dá)情況。通過慢病毒載體將Bit1的干擾的質(zhì)?；蜻^表達(dá)Bit1基因的質(zhì)粒分別導(dǎo)入胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anc-1和Mia paca2細(xì)胞中，通過抗性篩選，建立穩(wěn)定沉默和穩(wěn)定過

6、表達(dá)Bit1的胰腺癌細(xì)胞株。
　　2.CCK8法檢測Bit1對胰腺癌細(xì)胞增殖及化療敏感性的影響，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期及凋亡，western blot檢測Bit1蛋白影響胰腺癌細(xì)胞增殖活性及化療敏感性的具體作用形式;利用Transwell和劃痕實驗檢測Bit1與胰腺癌細(xì)胞運動、遷移、侵襲及轉(zhuǎn)移的關(guān)系，western blot檢測其可能的作用機制。
　　3.應(yīng)用western blot和免疫共沉淀技術(shù)檢測Bit1蛋白影響胰

7、腺癌細(xì)胞惡性表型的相關(guān)機制。
　　4.利用胰腺癌組織微陣列平臺結(jié)合免疫組織化學(xué)技術(shù)(Immunohistochemistry，IHC)檢測胰腺癌病人癌組織及癌旁組織中Bit1的表達(dá)情況，分析Bit1與胰腺癌病人臨床病理特征及胰腺癌患者預(yù)后的關(guān)系。
　　結(jié)果:
　　1.在實驗室已驗證的六株胰腺癌細(xì)胞株中，Panc-1胰腺癌細(xì)胞株在mRNA及蛋白水平的Bit1表達(dá)是最高的，而Mia paca2細(xì)胞的表達(dá)是最低的。以Panc

8、-1及Mia paca2為親本株分別成功構(gòu)建穩(wěn)定沉默以及過表達(dá)Bit1蛋白的胰腺癌細(xì)胞株。
　　2.敲低Bit1的表達(dá)并未明顯影響胰腺癌Panc-1細(xì)胞株的增殖，但可抑制懸浮培養(yǎng)Panc1細(xì)胞的凋亡，增加貼壁培養(yǎng)細(xì)胞的化療敏感性并促進(jìn)其凋亡。然而，在胰腺癌Mia paca2細(xì)胞過表達(dá)Bit1蛋白后，胰腺癌Mia paca2細(xì)胞的增殖亦無明顯差異，但可增加懸浮培養(yǎng)胰腺癌細(xì)胞的凋亡比例，抑制貼壁培養(yǎng)的胰腺癌細(xì)胞的化療敏感性并抑制其凋亡

9、。Bit1敲減的胰腺癌Panc1細(xì)胞的運動侵襲能力明顯增強，而過表達(dá)Bit1蛋白后胰腺癌Mia paca2細(xì)胞的運動侵襲能力受到抑制。
　　3.Western blot顯示Bit1通過影響caspase3、PARP、cleaved caspase3以及cleavedPARP的表達(dá)影響胰腺癌細(xì)胞的凋亡，并通過改變一系列上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT)過程相關(guān)蛋白的表達(dá)影響腫瘤細(xì)胞的運動侵襲以及轉(zhuǎn)移能力。Bit1可能通過調(diào)控Erk通路的活性影響

10、胰腺癌細(xì)胞的運動侵襲能力。
　　4.對人胰腺癌組織微陣列切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Bit1蛋白在胰腺癌病人癌旁組織的表達(dá)水平顯著高于癌組織(P＜0.05)，且Bit1在胰腺癌組織中的表達(dá)水平與病人血清中的CEA水平以及神經(jīng)浸潤有相關(guān)性(P＜0.05)。單因素生存分析顯示，飲酒、腫瘤分化程度、N分期、M分期和TNM分期與預(yù)后有相關(guān)性（P＜0.05），多因素Cox比例風(fēng)險回歸模型提示飲酒、N1期、TNM分期中的Ⅲ-Ⅳ期是患者不

11、良預(yù)后的獨立危險因素(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　Bit1蛋白在胰腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)存在明顯差異，Bit1對胰腺癌細(xì)胞的增殖無明顯影響，但敲低Bit1可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移，并影響其化療敏感性。Bit1蛋白可通過調(diào)控胰腺癌細(xì)胞的EMT表型來影響腫瘤細(xì)胞的運動侵襲能力，其過程可能與Erk通路的激活存在關(guān)聯(lián)性。Bit1蛋白在胰腺癌組織中低表達(dá)，并與胰腺癌的神經(jīng)浸潤密切相關(guān)，Biti蛋白可能與其他臨床指標(biāo)結(jié)合共同影響胰腺