SEMA3C調(diào)控胰腺癌生長和轉(zhuǎn)移的作用與機(jī)制研究.pdf

1、背景與意義：
　　最近的流行病學(xué)研究表明，胰腺導(dǎo)管腺癌是惡性程度高，致死率高，預(yù)后極差的惡性腫瘤。隨著環(huán)境污染、生活節(jié)奏的加快、診斷手段的改進(jìn)，胰腺癌的發(fā)病率越來越高。胰腺癌的5年生存率低于6％，且確診后大部分患者已有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，只有約20％的病人有手術(shù)機(jī)會[1，41]。多種因素導(dǎo)致胰腺癌患者的低生存期，其中最主要的因素是早期診斷方式的缺乏，大部分患者確診時已經(jīng)屬于中晚期，85％的患者確診時已經(jīng)并發(fā)有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，失去了手術(shù)切除的機(jī)會，

2、即使手術(shù)切除5年生存率也只有25％[1,3]。尸檢發(fā)現(xiàn)，90％胰腺癌患者并發(fā)有遠(yuǎn)處器官臟器的轉(zhuǎn)移[42]。因此，研究胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，并研發(fā)新的早期診斷標(biāo)志物成為現(xiàn)階段腫瘤生物研究的熱點。
　　信號素是調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、形態(tài)、功能以及細(xì)胞間相互作用的可溶性蛋白質(zhì)家族，其主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和胞膜上[6]。在哺乳動物中已經(jīng)有20種信號素，并且分為五類（信號素3-7）[43]。所有的信號素都具有由約500個氨基酸組成的氨基末

3、端sema結(jié)構(gòu)域[44]。信號素semaphorin的大部分效應(yīng)是由信號叢蛋白plexin介導(dǎo)的，信號叢蛋白是一組九個跨膜受體，可以細(xì)分為四類，叢蛋白A-D。信號素semaphorin和叢蛋白plexin廣泛表達(dá)于哺乳動物體內(nèi)，但是兩個蛋白家族的成員通常具有特異性的表達(dá)模式。信號素-神經(jīng)叢系統(tǒng)在發(fā)育期間和成年生物體內(nèi)涉及多種作用，特別是在神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和血管生成期間[7，45-49]。在過去的10年中，對信號素神經(jīng)叢蛋白在分子和細(xì)胞

4、功能中的作用機(jī)制有一定的研究，其中許多信號素叢蛋白在特定的疾病中起著關(guān)鍵性的作用。阻斷信號素神經(jīng)叢信號傳導(dǎo)的效應(yīng)分析通常使用缺乏特定信號素或神經(jīng)叢素的敲除小鼠模型，或RNA干擾技術(shù)抑制信號素或神經(jīng)叢表達(dá)的動物模型[50]。目前小分子藥物和各種生物制劑也已經(jīng)在臨床前疾病模型中開發(fā)和測試，這些最新的發(fā)現(xiàn)在越來越多文獻(xiàn)中報道，主要闡明阻斷或者促進(jìn)信號素神經(jīng)叢樣信號傳導(dǎo)以預(yù)防或治療特定疾病的機(jī)制。在過去五年中，在信號素和神經(jīng)叢蛋白的結(jié)構(gòu)方面的研

5、究也取得了一定的進(jìn)展，信號素和神經(jīng)叢蛋白的sema結(jié)構(gòu)域之間的結(jié)合界面的研究，促進(jìn)了信號素神經(jīng)肽相互作用特異機(jī)制的研究。信號素和神經(jīng)叢蛋白在調(diào)節(jié)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，以及在骨轉(zhuǎn)移和微血管疾病中起著中樞作用，并且能控制組織的再生，它們還在炎癥、自身免疫和其他免疫性疾病中起到關(guān)鍵性的作用。
　　semaphorin3s是分泌型蛋白，主要包括semaphorin3a、semaphorin3b、semaphorin3c、semaphorin3d

6、、semaphorin3e、semaphorin3F等。其中大部分semaphorin起到抑制腫瘤生長的作用，如sema3a、sema3b、sema3e、sema3F等。研究發(fā)現(xiàn)sema3c在多種腫瘤組織中高表達(dá)，并起到促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的作用，如胃癌、肝癌、乳腺癌、口腔腫瘤等[9，13，51，52]。S ema3c的表達(dá)還和胃癌、乳腺癌的預(yù)后成正相關(guān)[17，20]。在體外細(xì)胞實驗的研究中發(fā)現(xiàn)，sema3c能促進(jìn)上皮細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移

7、及卷曲形成血管，因此和腫瘤內(nèi)新生血管的形成密切相關(guān)[18，53]。近期的一項研究發(fā)現(xiàn)，full-length sema3c能抑制腫瘤淋巴管的形成及轉(zhuǎn)移。綜上所述，sema3c可能在不同的腫瘤中具有不同的作用，但是其具體的分子調(diào)控機(jī)制及臨床意義還有待研究。目前關(guān)于sema3c在胰腺導(dǎo)管腺癌中的作用及機(jī)制還沒有相關(guān)文獻(xiàn)報道。
　　上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，是指上皮細(xì)胞在特定的病理生理情況下向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象。在多種腫瘤的進(jìn)展過程中，

8、EMT和腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其中包括肝癌、胃癌、胰腺癌等消化道腫瘤[54]。EMT時會導(dǎo)致相關(guān)上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白表達(dá)的減少，而致間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白的表達(dá)增加[55]。在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中，EMT可能激活一種類似胚胎發(fā)育的過程，為細(xì)胞的遷移和轉(zhuǎn)移提供能力，Herman等研究表明，在前列腺癌細(xì)胞系中過表達(dá)sema3c后，會下調(diào)兩個重要的上皮細(xì)胞標(biāo)志E-cadherin和α-catenin，而使細(xì)胞的侵襲能力增強(qiáng)。因此sema3c可

9、能通過調(diào)控EMT促進(jìn)胰腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。
　　多個信號通路在EMT調(diào)節(jié)腫瘤的進(jìn)展中起著重要作用，如β Wnt/β-catenin、JAK/STAT3，NF-κBκ和ERK1/2信號通路。研究表明，ERK1/2信號通路在EMT誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲過程中起著重要的作用，且在腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移以及EMT過程中也起著關(guān)鍵性作用[28]。在多種腫瘤中ERK1/2的磷酸化水平均增加，其中包括胰腺癌。javle等研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌中ERK1

10、/2磷酸化的增強(qiáng)，以及EMT過程與患者的預(yù)后密切相關(guān)[40]。因此在胰腺癌中，ERK1/2信號通路可能參與調(diào)控EMT過程。
　　目的:
　　1.檢測sema3c在胰腺癌腫瘤組織及胰腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況。
　　2.研究sema3c在胰腺癌腫瘤組織中的表達(dá)和臨床的相關(guān)性，并分析其在腫瘤細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移中的作用。
　　3.觀察sema3c是否通過調(diào)控EMT進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。
　　4.探討ERK1/2信

11、號通路是否在sema3c調(diào)控胰腺癌細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及EMT的過程中起著一定的作用。
　　方法:
　　1.首先通過RT-PCR，qRT-PCR和Westemblot檢測sema3c在胰腺癌腫瘤組織及正常胰腺組織中的表達(dá)情況，RT-PCR，qRT-PCR檢測sema3c在胰腺癌細(xì)胞株AsPC-1，BxPC-3，PANC-1，CFPAC-1和Hs766T中的表達(dá)水平。通過免疫組化觀察sema3c在胰腺癌腫瘤組織中的表達(dá)和定位情

12、況，并通過統(tǒng)計學(xué)分析其與TNM分期、腫瘤大小、患者年齡和患者術(shù)后生存期及復(fù)發(fā)的關(guān)系。
　　2.通過慢病毒轉(zhuǎn)染干擾sema3c在胰腺癌細(xì)胞株BxPC-3中的表達(dá)，并通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染過表達(dá)sema3c在胰腺癌細(xì)胞株CFPAC-1中的表達(dá)。轉(zhuǎn)染后，通過CCK8試劑盒檢測各組細(xì)胞的增殖情況，同時利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測各組細(xì)胞的凋亡情況。
　　3.通過Transwell實驗和劃痕實驗觀察轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，并通過Western

13、blot檢測各組細(xì)胞中上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白α-catenin、E-cadherin，以及間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白N-cadherin和ZEB2的表達(dá)情況。
　　4.免疫組化檢測ERK1/2在胰腺癌腫瘤組織中的磷酸化情況，并通過linearregressin方法分期其表達(dá)與sema3c表達(dá)的相關(guān)性。用ERK1/2信號通路抑制劑U0126刺激胰腺癌細(xì)胞后，用CCK8試劑盒檢測各組細(xì)胞的增殖情況，同時利用Transwell實驗檢測細(xì)胞的侵襲能力，并

14、通過Western blot檢測各組細(xì)胞中上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白α-catenin、E-cadherin，以及間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白N-cadherin和ZEB2的表達(dá)情況。
　　5.通過NOD/SCID老鼠的成瘤實驗觀察sema3c在小鼠體內(nèi)對胰腺癌細(xì)胞成瘤的影響。
　　結(jié)果:
　　1.Sema3c在胰腺癌腫瘤組織中的表達(dá)升高，且在不同胰腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)水平不一致，在BxPC-3中的表達(dá)最高，在CFPAC-1中的表達(dá)最低。

15、r>　　2.Sema3c在胰腺癌腫瘤組織中的表達(dá)水平和TNM分期成正相關(guān)，與患者術(shù)后生存期成負(fù)相關(guān)。
　　3.Sema3c能促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖，并抑制胰腺癌細(xì)胞的凋亡。
　　4.Sema3c可能通過調(diào)控EMT促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。
　　5.Sema3c通過ERK1/2信號通路調(diào)控胰腺癌細(xì)胞增殖、侵襲及EMT。
　　6.在小鼠體內(nèi)，sema3c能夠促進(jìn)腫瘤的生長。
　　結(jié)論:
　　Sema3c在