VEGF-C對(duì)胰腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制及其與預(yù)后相關(guān)性的研究.pdf

1、胰腺癌是預(yù)后最為惡劣的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，90[％]的患者就診時(shí)已屬進(jìn)展期，治療手段單一，手術(shù)切除率低，5年生存率不超過5[％]。而胰腺癌早期即可發(fā)生區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，是影響患者預(yù)后的重要因素。因此，對(duì)胰腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移機(jī)制及干預(yù)手段的深入研究具有重要的意義。
　　 VEGF-C基因是1996年被克隆定位于人染色體4q34上的一個(gè)新基因。近年來的大量研究結(jié)果顯示，其與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移高度特異性相關(guān)。目前認(rèn)為，VEGF-C通過結(jié)合淋巴

2、管內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)的受體VEGFR-3促進(jìn)腫瘤“淋巴管生成”是腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵機(jī)制之一。但實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，沉默VEGFR-3的表達(dá)以抑制腫瘤“淋巴管生成”對(duì)已轉(zhuǎn)移至淋巴結(jié)的腫瘤細(xì)胞并無抑制作用。因此，對(duì)就診時(shí)多已發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胰腺癌患者來說，抑制腫瘤“淋巴管生成”的效果可能并不樂觀。
　　 最近，有研究結(jié)果提示腫瘤細(xì)胞VEGF-C的異常表達(dá)與腫瘤細(xì)胞寄生部位的局部微環(huán)境關(guān)系密切。進(jìn)一步通過免疫組織化學(xué)染色的方法，在乳腺癌原位種

3、植瘤模型中發(fā)現(xiàn)存在部分轉(zhuǎn)移至淋巴管內(nèi)的乳腺癌細(xì)胞VEGF-C陽性表達(dá)增多的情況；而對(duì)人胰腺癌標(biāo)本中也發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)移至淋巴結(jié)的胰腺癌細(xì)胞VEGF-C染色陽性率明顯高于原發(fā)灶的有趣現(xiàn)象。
　　 那么，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶局部微環(huán)境的影響下，胰腺癌細(xì)胞VEGF-C表達(dá)是否存在器官差異性呢？如果存在，這種差異性對(duì)胰腺癌細(xì)胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移又發(fā)揮何種作用，能否為我們提供一個(gè)抑制胰腺癌細(xì)胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的新思路呢？通過對(duì)VEGF-C在胰腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中作用的進(jìn)

4、一步認(rèn)識(shí)，其能否成為判斷胰腺癌預(yù)后的一種輔助指標(biāo)呢？
　　 為此，我們進(jìn)行了以下三個(gè)部分的研究。
　　 第一部分、VEGF-C在胰腺癌細(xì)胞種植瘤模型原位灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中表達(dá)的差異性
　　 目的：
　　 研究胰腺癌PANC-1細(xì)胞在原位種植瘤模型原位灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中VEGF-C表達(dá)的差異性。
　　 方法：
　　 建立胰腺癌PANC-1細(xì)胞原位種植瘤模型，原代分離培養(yǎng)原位灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中

5、腫瘤細(xì)胞，通過RT-PCR、Western Blot、ELISA等方法檢測(cè)其VEGF-C的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 胰腺癌PANC-1細(xì)胞原位種植瘤模型成瘤率100.0[％]，自發(fā)性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生率為62.5[％]，自發(fā)性肝轉(zhuǎn)移發(fā)生率為25.0[％]，未見肺轉(zhuǎn)移。
　　 將原代分離培養(yǎng)的原位灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中胰腺癌細(xì)胞分別命名為PANC-1-PRO和PANC-1-LN細(xì)胞。兩細(xì)胞中VEGF-C基因mRNA表

6、達(dá)水平分別為0.61±0.15與0.87±0.11，細(xì)胞中的VEGF-C蛋白表達(dá)水平分別為0.65±0.17與0.88±0.09，細(xì)胞培養(yǎng)液上清液中VEGF-C蛋白表達(dá)含量分別為(1403.67±128.15)pg/ml與(1682.37±156.73)pg/ml，PANC-1-LN細(xì)胞VEGF-C的表達(dá)水平均明顯高于PANC-1-PRO細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.1255、2.9062、3.0782，P=0.0141、0.0197

7、、0.0152)。
　　 結(jié)論：
　　 原位種植瘤模型自發(fā)性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中胰腺癌PANC-1細(xì)胞的VEGF-C表達(dá)水平顯著高于原位灶中腫瘤細(xì)胞，胰腺癌細(xì)胞的VEGF-C表達(dá)存在器官差異性。
　　 第二部分、VEGF-C特異性反義寡核苷酸對(duì)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶胰腺癌細(xì)胞凋亡的影響
　　 目的：
　　 研究VEGF-C特異性反義寡核苷酸對(duì)原位灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中胰腺癌細(xì)胞凋亡的影響。
　　 方法：

8、>　　 建立胰腺癌PANC-1細(xì)胞原位種植瘤模型，原代分離培養(yǎng)原位灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中腫瘤細(xì)胞(PANC-1-PRO和PANC-1-LN細(xì)胞)，分為空白對(duì)照、錯(cuò)義寡核苷酸、反義寡核苷酸3個(gè)處理組。應(yīng)用RT-PCR、Western Blot、ELISA、流式細(xì)胞術(shù)、TUNEL等方法檢測(cè)VEGF-C反義寡核苷酸的體內(nèi)外轉(zhuǎn)染對(duì)其表達(dá)水平以及對(duì)胰腺癌細(xì)胞凋亡的影響。
　　 結(jié)果：
　　 體外轉(zhuǎn)染后，反義組PANC-1-PRO和P

9、ANC-1-LN細(xì)胞中VEGF-C的mRNA、蛋白表達(dá)水平及細(xì)胞培養(yǎng)液上清液中蛋白表達(dá)含量均較空白、錯(cuò)義組顯著降低(P＜0.01)。而3組PANC-1-PRO和PANC-1-LN細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因bcl-2的mRNA表達(dá)水平分別為0.67±0.12、0.69±0.14、0.61±0.11和0.56±0.16、0.59±0.18、0.27±0.17，僅PANC-1-LN細(xì)胞的反義組bcl-2表達(dá)水平較前2組明顯下調(diào)(t=3.0428、3.

10、1659，P=0.0124、0.0101)。PANC-1-PRO細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，3組的早期細(xì)胞凋亡率分別為(3.51±1.38)[％]、(4.79±2.16)[％]、(5.33±2.18)[％]，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.7279、0.4310，P=0.1147、0.6756)；而PANC-1-LN細(xì)胞3組早期細(xì)胞凋亡率分別為(2.83±1.01)[％]、(4.98±2.05)[％]、(13.22±2.17)[％]，反義組細(xì)胞凋亡率顯著上升

11、，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.6329、6.7613，P=0.0000、0.0000)。
　　 體內(nèi)轉(zhuǎn)染后，反義組種植瘤模型血清中VEGF-C蛋白含量較空白、錯(cuò)義組顯著降低(P＜0.05)。3組模型瘤體體積、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生率及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)數(shù)的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。3組原位灶胰腺癌細(xì)胞凋亡率分別為(1.29±0.53)[％]、(1.98±0.77)[％]、(2.01±0.80)[％]，組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2

12、.1221、0.0764，P=0.0522、0.9402)；而3組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶胰腺癌細(xì)胞平均凋亡率分別為(1.78±0.49)[％]、(1.96±0.68)[％]、(4.38±1.02)[％]，反義組細(xì)胞凋亡率顯著上升，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.4987、5.2301，P=0.0000、0.0001)。
　　 結(jié)論：
　　 抑制淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中胰腺癌細(xì)胞VEGF-C的表達(dá)可促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中胰腺癌細(xì)胞的凋亡，和bcl-

13、2表達(dá)下調(diào)有關(guān)；但對(duì)原發(fā)灶胰腺癌細(xì)胞無明顯影響。VEGF-C基因的作用機(jī)制也存在器官差異性，是胰腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的機(jī)制之一。
　　 第三部分、無法切除胰腺癌患者血清VEGF-C蛋白含量與預(yù)后相關(guān)性的研究
　　 目的：
　　 研究無法切除胰腺癌患者血清中VEGF-C蛋白含量與預(yù)后的關(guān)系。
　　 方法：
　　 選擇華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院胰腺外科中心2004年12月～2005年8月間無法切除的

14、局部晚期胰腺癌病例35例，記錄入組時(shí)的KPS評(píng)分、CT資料的腫瘤最大直徑及血清CA19-9值等相關(guān)指標(biāo)。ELISA檢測(cè)患者血清中VEGF-C蛋白含量，并選擇10例健康者血清作為對(duì)照。應(yīng)用Kaplan-Meier法計(jì)算生存率，并繪制生存曲線，Log-rank法檢驗(yàn)不同變量間生存率的差異，Cox回歸模型進(jìn)行預(yù)后的單因素分析和多因素分析。
　　 結(jié)果：
　　 35例胰腺癌患者血清中VEGF-C蛋白含量平均值為(1309.23±

15、542.05)pg/ml，10例對(duì)照者為(256.13±96.59)pg/ml，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 將35例胰腺癌患者的年齡、腫瘤最大直徑、腫瘤生長(zhǎng)部位、KPS評(píng)分、血清CA19-9值及VEGF-C值等指標(biāo)一起納入Cox風(fēng)險(xiǎn)模型，進(jìn)行預(yù)后單因素分析，發(fā)現(xiàn)KPS評(píng)分、血清CA19-9值及VEGF-C值均入選為無法切除的晚期胰腺癌患者預(yù)后影響因素(χ2=7.208、6.908、3.867，P=0.007、0.0

16、29、0.049)。
　　 對(duì)上述篩選變量進(jìn)行多因素Cox回歸模型分析，引入標(biāo)準(zhǔn)為0.10、刪除標(biāo)準(zhǔn)為0.11，采用后退法，發(fā)現(xiàn)最先退出模型的是CA19-9值(χ2=3.738，P=0.053)，然后是VEGF-C(χ2=4.873，P=0.027)，最后是KPS評(píng)分(χ2=5.274，P=0.022)，。
　　 比較KPS評(píng)分＜70分與≥70分的兩組病例預(yù)后，結(jié)果顯示2組平均生存時(shí)間分別為6.60月與10.11月，1年

17、累積生存率分別為21.43[％]與33.33[％]；取胰腺癌患者血清中VEGF-C蛋白含量中位數(shù)1280pg/ml為分界點(diǎn)，比較血清VEGF-C值≤1280pg/ml與＞1280pg/ml的兩組病例預(yù)后，結(jié)果顯示2組平均生存時(shí)間分別為11.26月與6.29月，1年累積生存率分別為50.00[％]與5.88[％]；KPS評(píng)分及血清VEGF-C值的組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.0400、9.4000，P=0.0443、0.0022)。而

18、血清CA19-9值≤200U /ml與＞200U/ml的兩組病例，平均生存時(shí)間分別為9.99月與7.76月，1年累積生存率分別為37.50[％]與21.05[％]，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.9100，P=0.1667)。
　　 結(jié)論：
　　 無法切除的局部晚期胰腺癌患者，其KPS評(píng)分和預(yù)后顯著相關(guān)，可作為預(yù)后的獨(dú)立影響因素；而血清中VEGF-C蛋白含量值與CA19-9值均和預(yù)后存在一定關(guān)系，可作為預(yù)后判斷的輔助參考指標(biāo)