miRNA-222參與調(diào)控胰腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移分子機(jī)制的研究.pdf

1、前言：
　　胰腺癌是惡性程度最高的消化道惡性腫瘤之一，疾病進(jìn)展快，預(yù)后差，易復(fù)發(fā)，中位生存期短，5年生存率不超過5％，是全球第八位腫瘤相關(guān)死亡原因，又被稱為“癌中之王”[1,2]。目前胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移調(diào)控的分子機(jī)制尚未完全明確，因此，研究胰腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制可能為開發(fā)治療胰腺癌的新型分子靶向治療藥物提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，從而改善胰腺癌的術(shù)后生存期和預(yù)后。
　　在前期研究中，利用BOP誘導(dǎo)敘利亞倉鼠實(shí)驗(yàn)性胰腺癌模型，建立了

2、非解離型低轉(zhuǎn)移株胰腺癌細(xì)胞系(PC-1)，再將PC-1細(xì)胞經(jīng)尾靜脈種植倉鼠體內(nèi)，取轉(zhuǎn)移癌建立了解離型高轉(zhuǎn)移株胰腺癌細(xì)胞系(PC-1.0)。研究發(fā)現(xiàn)這兩種同源細(xì)胞具有明顯不同的增殖和運(yùn)動能力。另外，我們近期對MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究證實(shí)MEK1和MEK2基因密切參與調(diào)控胰腺癌細(xì)胞增值凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移的調(diào)控[3-5]。
　　現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)microRNA(miRNA)參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、代謝和凋亡，組織和神經(jīng)的發(fā)育，血管的發(fā)生以及腫瘤的

3、發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移等多種生理和病理過程。盡管miRNA參與了大部分細(xì)胞基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，但在腫瘤組織和正常組織中的表達(dá)卻存在明顯差異[6，7]。部分miRNA在腫瘤組織中低表達(dá)，提示這些miRNA在腫瘤中可能發(fā)揮著抑癌基因的作用;相對的，還有一些miRNA在腫瘤組織中高表達(dá)，提示它們在腫瘤中可能發(fā)揮著致癌基因的作用[8]。最近又有研究發(fā)現(xiàn)人體組織中miRNA的表達(dá)譜可用于癌癥的診斷以及預(yù)測癌癥的預(yù)后等[9]。MicroRNA的差異表達(dá)與腫瘤發(fā)

4、生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系及其潛在的診斷和治療價(jià)值已經(jīng)成為當(dāng)前的一個研究熱點(diǎn)。
　　在前期研究中我們利用miRNAmicroarray方法，篩選出包括miRNA-222（以下簡稱miR-222）在內(nèi)的解離型高轉(zhuǎn)移株P(guān)C-1.0細(xì)胞系與非解離型低轉(zhuǎn)移株P(guān)C-1細(xì)胞系的差異miRNAs，其中在PC-1.0細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)miRNAs14個，表達(dá)下調(diào)miRNAs7個。miR-222在解離型高轉(zhuǎn)移胰腺癌細(xì)胞株P(guān)C-1.0中表達(dá)下調(diào)，而在非解離型

5、低轉(zhuǎn)移胰腺癌細(xì)胞株P(guān)C-1中表達(dá)上調(diào)。
　　絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activatedproteinkinase，MAKP)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路幾乎存在于所有真核生物細(xì)胞中，為三級激酶體系:MAPK，絲裂原活化蛋白激酶激酶(MAPkinasekinase，MKK或MEK)和絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶(MAPkinasekinasekinase，MAPKKK)。MEK1和MEK2是MEK家族的重要成員，作為MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中

6、的重要激酶分子，參與了多數(shù)細(xì)胞的生理和病理學(xué)進(jìn)程，包括細(xì)胞增殖、分化、應(yīng)激、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等。miR-222在胰腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移調(diào)控中的作用及其與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的相互關(guān)系尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。
　　目的：
　　在本研究中擬利用Realtime-PCR、細(xì)胞轉(zhuǎn)染及miRNA功能解析方法檢測miR-222在不同的胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)并探討miR-222參與調(diào)控胰腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。
　　材料與方法：
　　一、材料

7、r>　　采用倉鼠非解離型低轉(zhuǎn)移株胰腺癌細(xì)胞系PC-1及人胰腺癌Capan-2細(xì)胞系和倉鼠解離型高轉(zhuǎn)移株胰腺癌細(xì)胞系PC-1.0及人胰腺癌Aspc-1細(xì)胞系。PC-1細(xì)胞系是利用BOP誘導(dǎo)的敘利亞倉鼠實(shí)驗(yàn)性胰腺癌模型建立。PC-1.0細(xì)胞系是由同系倉鼠尾靜脈種植PC-1細(xì)胞后產(chǎn)生的腫瘤而建立。上述兩種細(xì)胞系呈不同形態(tài)學(xué)方式生長。PC-1細(xì)胞呈島樣細(xì)胞克隆方式生長，PC-1.0細(xì)胞主要呈單個細(xì)胞方式生長。Aspc-1細(xì)胞系在形態(tài)學(xué)方面類似P

8、C-1.0細(xì)胞系，而Capan-2細(xì)胞系則類似PC-1細(xì)胞系。本實(shí)驗(yàn)還用到前期研究中建立的PC-1.0MEK1基因敲減和PC-1.0MEK2基因敲減細(xì)胞株。
　　本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的miR-222抑制劑(inhibitor)和類似物(mimics)均由Lifetechonology公司設(shè)計(jì)合成，miR-222探針及內(nèi)參U6由Lifetechonology公司設(shè)計(jì)合成，載體RNAiMAX購自Lifetechonology公司。miRNA提

9、取試劑盒購自Lifetechonology公司。
　　二、方法
　　通過Realtime-PCR驗(yàn)證miR-222在不同胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)差異。對解離型高轉(zhuǎn)移胰腺癌細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染miR-222mimics，對非解離型低轉(zhuǎn)移胰腺癌細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染miR-222inhibitor，并通過觀察細(xì)胞形態(tài)、WoundHealing細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)、CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、PI細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)等探討miR-222在胰腺癌細(xì)

10、胞中的作用。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　一、驗(yàn)證miR-222在解離型高轉(zhuǎn)移株胰腺癌細(xì)胞和非解離型低轉(zhuǎn)移株胰腺癌細(xì)胞中的差異表達(dá)
　　為驗(yàn)證前期研究miRNAmicroarray的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)利用Realtime-PCR進(jìn)一步驗(yàn)證在倉鼠解離型高轉(zhuǎn)移胰腺癌細(xì)胞(PC-1.0)和倉鼠非解離型低轉(zhuǎn)移胰腺癌細(xì)胞（PC-1）中miR-222的差異表達(dá)，并與在人胰腺癌細(xì)胞Aspc-1和Capan-2中miR-222的差異表達(dá)作對比。

11、結(jié)果證實(shí)miR-222在PC-1.0和PC-1細(xì)胞中的差異表達(dá)與前期mIRNAmicroarray的結(jié)果一致，PC-1.0細(xì)胞中miR-222的表達(dá)較PC-1細(xì)胞下調(diào)(P＜0.05)。在與上述細(xì)胞性狀相似的人胰腺癌細(xì)胞Aspc-1和Capan-2中，miR-222表達(dá)同樣為在Aspc-1中較Capan-2中表達(dá)下調(diào)(P＜0.05)。
　　二、解離型高轉(zhuǎn)移胰腺癌細(xì)胞和非解離型低轉(zhuǎn)移胰腺癌細(xì)胞中分別瞬時轉(zhuǎn)染miR-222inhibit

12、or及mimics并檢測轉(zhuǎn)染效率
　　分別對各細(xì)胞株進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染miR-222inhibitor和mimics24小時后，用Realtime-PCR檢測其轉(zhuǎn)染效率。PC-1細(xì)胞中miR-222表達(dá)抑制率為83.9％(P＜0.05)，Capan-2細(xì)胞中抑制率為97.1％(P＜0.05);PC-1.0細(xì)胞中miR-222表達(dá)增強(qiáng)587％(P＜0.05)，Aspc-1細(xì)胞中miR-222表達(dá)增強(qiáng)8781％(P＜0.05)。
　　

13、三、miR-222的生物學(xué)功能解析
　　1、非解離型低轉(zhuǎn)移胰腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-222inhibitor（抑制實(shí)驗(yàn)）
　　瞬時轉(zhuǎn)染miR-222inhibitor后明顯增強(qiáng)了倉鼠非解離型低轉(zhuǎn)移胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移能力，并且在細(xì)胞形態(tài)學(xué)上有所改變，然而在增殖和細(xì)胞周期方面作用不顯著。在人胰腺癌細(xì)胞株Capan-2中各方面作用均不顯著。
　　2、解離型高轉(zhuǎn)移胰腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-222mimics（激動實(shí)驗(yàn)）
　　瞬時轉(zhuǎn)染

14、miR-222mimics后倉鼠解離型高轉(zhuǎn)移胰腺癌細(xì)胞系PC-1.0和人胰腺癌細(xì)胞系A(chǔ)spc-1的侵襲轉(zhuǎn)移能力明顯減弱，然而在增殖和細(xì)胞周期方面作用不顯著。
　　四、miR-222與MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)系
　　利用前期研究中建立的PC-1.0MEK1基因敲減胰腺癌細(xì)胞株和PC-1.0MEK2基因敲減胰腺癌細(xì)胞株，通過Realtime-PCR檢測miR-222的表達(dá)變化，結(jié)果顯示PC-1.0MEK1和MEK2基因敲減胰腺癌