MiR-221促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞自吞噬并靶向調(diào)控c-Fos抑制胰腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：胰腺癌是一種惡性程度極高、預(yù)后差的惡性腫瘤。其具有早期診斷率低，早期即發(fā)生原位及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等特點(diǎn).而胰腺癌細(xì)胞的高度侵襲和轉(zhuǎn)移特性是胰腺癌預(yù)后較差的重要原因之一。胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制目前尚未完全闡明。為改善胰腺癌預(yù)后，針對(duì)胰腺癌的高度侵襲轉(zhuǎn)移特性，開發(fā)抑制胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的特異性分子靶向治療方法，從而改善胰腺癌患者的預(yù)后，是亟待解決的主要問題。MicroRNA是一類由內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度約為18-25個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，

2、作用于多種信使RNA(mRNA)，導(dǎo)致信使RNA的翻譯抑制或降解。越來越多的研究表明，microRNA可通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的侵襲，轉(zhuǎn)移，凋亡，增殖，自吞噬等，在腫瘤的發(fā)生，發(fā)展，診斷，預(yù)后和治療中扮演至關(guān)重要的作用。在前期研究中，我們利用倉鼠低侵襲株(PC-1)和移植后早期高頻率發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的高侵襲株(PC-1.0)胰腺癌細(xì)胞，進(jìn)行了microRNA的差異性表達(dá)比較研究。我們的前期研究證實(shí)，對(duì)比低侵襲性胰腺癌細(xì)胞，miR-221在高侵襲性胰

3、腺癌細(xì)胞中穩(wěn)定低表達(dá)。然而，miR-221是否作用于胰腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移作用有待研究。本實(shí)驗(yàn)的目的寄深入探討miR-221在胰腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用，及其可能的分子機(jī)制。并探討miR-221是否可以調(diào)節(jié)胰腺癌細(xì)胞的自吞噬功能，以及其可能的作用機(jī)制。
　　方法：利用細(xì)胞形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證過表達(dá)miR-221是否調(diào)控胰腺癌細(xì)胞的形態(tài)改變。利用Wound Healing遷移實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證過表達(dá)miR-221是否調(diào)控胰腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移功能。利用

4、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證過表達(dá)miR-221是否調(diào)控胰腺癌細(xì)胞的侵襲功能。在前期研究中，通過生物學(xué)預(yù)測(cè)網(wǎng)站，我們預(yù)測(cè)c-Fos可能為miR-221調(diào)控的下游靶基因。本次試驗(yàn)中，利用熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)證實(shí)c-Fos是否為miR-221的直接調(diào)控的下游靶基因。并利用Western Blotting驗(yàn)證miR-221對(duì)于c-Fos蛋白表達(dá)的調(diào)控作用。而后，利用Wound Healing遷移實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證抑制c-Fos蛋白表達(dá)是否調(diào)控胰腺

5、癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移功能。利用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證驗(yàn)證抑制c-Fos蛋白表達(dá)是否調(diào)控胰腺癌細(xì)胞的侵襲功能。并利用Western Blotting驗(yàn)證c-Fos對(duì)金屬基質(zhì)蛋白酶7（MMP-7）蛋白的表達(dá)的調(diào)控作用。從而揭示miR-221是否可以通過靶向調(diào)控c-Fos，調(diào)控胰腺癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移功能。利用Western Blotting驗(yàn)證過表達(dá)miR-221是否調(diào)控胰腺癌細(xì)胞的自吞噬功能。利用Western Blotting驗(yàn)證過表達(dá)

6、miR-221是否調(diào)控組蛋白去乙?；?(HDAC6)蛋白表達(dá)。利用免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證抑制HDAC6蛋白表達(dá)是否調(diào)控胰腺癌細(xì)胞的自吞噬功能。從而闡述miR-221調(diào)控胰腺癌細(xì)胞自吞噬的可能機(jī)制。
　　結(jié)果：通常情況下，PC-1.0和AsPC-1細(xì)胞呈單細(xì)胞方式生長(zhǎng)，然而，在上調(diào)miR-221的表達(dá)后，細(xì)胞生長(zhǎng)方式由單細(xì)胞方式生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變?yōu)閸u樣克隆樣生長(zhǎng)，miR-221可誘導(dǎo)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。Wound Healing轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在

7、上調(diào)miR-221的表達(dá)后，胰腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力下調(diào)。同時(shí)，Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在上調(diào)miR-221的表達(dá)后，胰腺癌細(xì)胞侵襲能力明顯下調(diào)。表明miR-221可抑制胰腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移功能。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)，c-Fos為miR-221的下游靶基因，并受miR-221反向調(diào)節(jié)。Western Blotting驗(yàn)證了雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，上調(diào)miR-221的表達(dá)后，胰腺癌細(xì)胞中c-Fos蛋白的表達(dá)量明顯下調(diào)。Wound

8、Healing轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在抑制c-Fos的表達(dá)后，胰腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力下調(diào)。同時(shí)，Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在抑制c-Fos的表達(dá)后，胰腺癌細(xì)胞侵襲能力明顯下調(diào)。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，下調(diào)c-Fos的表達(dá)后，胰腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力明顯受到抑制。因此，miR-221對(duì)于胰腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力的調(diào)控可能是通過調(diào)控c-Fos的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。與此同時(shí)，下調(diào)c-Fos表達(dá)可抑制MMP-7蛋白表達(dá)。證實(shí)了miR-221可能通過反向靶向調(diào)

9、節(jié)c-Fos，進(jìn)而調(diào)節(jié)MMP-7蛋白表達(dá)，從而達(dá)到調(diào)控胰腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的作用。Western Blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過表達(dá)miR-221后，胰腺癌細(xì)胞LC3蛋白表達(dá)上調(diào)，miR-221可調(diào)控胰腺癌細(xì)胞的自吞噬功能。同時(shí)，Western Blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過表達(dá)miR-221后，胰腺癌細(xì)胞HDAC6蛋白表達(dá)受到抑制。免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)證明，抑制胰腺癌細(xì)胞中HDAC6表達(dá)后，LC3在胰腺癌細(xì)胞胞質(zhì)中的含量顯著上調(diào)。以上