REG3A促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞惡性增殖及抑制腫瘤免疫的機(jī)制研究.pdf

1、目的：研究促胰島細(xì)胞再生和增殖的蛋白REG3A對胰腺癌細(xì)胞惡性增殖的作用機(jī)制，明確REG3A與膜受體EGFR結(jié)合對胰腺癌細(xì)胞增殖促進(jìn)作用；深入研究在IL-6介導(dǎo)的炎癥環(huán)境中，REG3A激活JAK2/STAT3信號通路對胰腺癌發(fā)生和發(fā)展作用。以及研究Reg3g（與人REG3A同源性最高）過表達(dá)對胰腺癌形成的免疫學(xué)機(jī)制，確定關(guān)鍵靶細(xì)胞即樹突狀細(xì)胞（DCs）和CD8+T細(xì)胞，為研究胰腺癌發(fā)病機(jī)制和尋找胰腺癌的藥物治療靶點(diǎn)提供新思路。
　

2、　方法：首先，以人胰腺癌細(xì)胞系SW1990、BxPC-3為研究對象，采用siRNA-REG3A干擾SW1990、BxPC-3細(xì)胞，通過MTT法，F(xiàn)ACS檢測細(xì)胞周期和凋亡，Real-time PCR和WB檢測JAK2/STAT3、CyclinD1、Bcl2、REG3A表達(dá)。進(jìn)一步阻斷JAK2、STAT3分子，研究JAK2/STAT3/REG3A正反饋環(huán)路。其次，采用免疫共沉淀分析REG3A介導(dǎo)何種受體激活下游JAK2/STAT3通路發(fā)揮

3、促胰腺癌細(xì)胞增殖作用。隨后，采用不同劑量的IL-6孵育BxPC-3細(xì)胞24h，篩選出IL-6介導(dǎo)JAK2/STAT3濃度依耐性上調(diào)REG3A的表達(dá)，采用siRNA-STAT3阻斷JAK2/STAT3信號通路，明確IL-6是否通過JAK2/STAT3信號通路促進(jìn)REG3A表達(dá)。采用Microarray尋找REG3A或IL-6作用于SW1990細(xì)胞的重要節(jié)點(diǎn)。隨后，建立裸鼠皮下移植瘤模型，進(jìn)一步明確REG3A聯(lián)合IL-6對裸鼠體內(nèi)腫瘤形成的

4、作用機(jī)制研究。最后，研究REG3A對胰腺癌形成的免疫學(xué)機(jī)制。ELISA檢測經(jīng)Reg3g處理的DCs細(xì)胞24h分泌TGF-β、IL-10、IFN-γ、IL-12P70。FACS檢測經(jīng)Reg3g及Panc02細(xì)胞模擬的腫瘤微環(huán)境處理后的DCs表面分子CD86和MHC-Ⅱ的表達(dá)。構(gòu)建皮下移植瘤及胰腺原位癌模型，待腫瘤形成后腹腔注射慢病毒Reg3g過表達(dá)質(zhì)粒（pReg3g）、Reg3g干擾質(zhì)粒（shReg3g）兩周后取樣，分析小鼠胰腺組織及脾臟

5、病理變化，血清生化指標(biāo)，檢測CD8+T、CD4+CD25+Foxp3+(Tregs)比例，DCs成熟和功能學(xué)指標(biāo)，腫瘤相關(guān)通路及增殖相關(guān)基因的表達(dá)，炎癥因子的表達(dá)。
　　結(jié)果：首先，采用siRNA-STAT3，AG490，siRNA-REG3A干擾STAT3，JAK2，REG3A表達(dá)后，可有效抑制REG3A對下游信號通路JAK2/STAT3的活化作用，及下游相關(guān)蛋白CyclinD1和Bcl2的表達(dá)及的Reg3g自分泌，抑制腫瘤細(xì)胞

6、增殖作用；同時采用免疫共沉淀明確REG3A結(jié)合細(xì)胞膜受體EGFR，干擾EGFR表達(dá)后，REG3A不能激活JAK2/STAT3通路促進(jìn)REG3A分泌，提示REG3A結(jié)合EGFR激活JAK2/STAT3/REG3A環(huán)路，加速胰腺癌細(xì)胞增殖。隨后，IL-6促進(jìn)BxPC-3細(xì)胞中REG3A的表達(dá)，在SW1990細(xì)胞中，采用siRNA-STAT3小干擾抑制STAT3表達(dá)后，IL-6不能有效激活JAK2/STAT3信號通路，促進(jìn)REG3A的表達(dá)。隨

7、后，通過Microarray基因分析初步篩選出REG3A與IL-6均能活化胰腺癌細(xì)胞增殖相關(guān)（RAS、TGF-β）信號通路，分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中STAT家族為其關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。進(jìn)而發(fā)現(xiàn)REG3A聯(lián)合IL-6體內(nèi)和體外促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞惡性增殖。最后，Reg3g抑制DCs的成熟，遷移和炎癥細(xì)胞因子IL-12、IFN-γ分泌，促進(jìn)其吞噬功能及抗炎細(xì)胞因子IL-10，TGF-β分泌；減弱局部腫瘤組織中CD8+T細(xì)胞浸潤，誘導(dǎo)Tregs表達(dá)上調(diào)及相關(guān)負(fù)性調(diào)控因

8、子如CD152及PD-1和PD-L1的表達(dá)；封閉CD8+T細(xì)胞后，腫瘤體積明顯增大，shReg3g不能發(fā)揮抑制腫瘤生長的作用，深入研究發(fā)現(xiàn)Re g3g促進(jìn)原位腫瘤的惡性增殖并介導(dǎo)免疫細(xì)胞中STAT3通路發(fā)揮抑制DCs抗原提呈及與CD8+T細(xì)胞之間cross-talk作用，同時Reg3g激活胰腺癌組織中STAT3通路，促進(jìn)下游分子Ki67過表達(dá)，下調(diào)SOCS3、caspase3的表達(dá)，促進(jìn)胰腺癌的形成和發(fā)展。
　　結(jié)論：IL-6結(jié)合

9、IL-6R和gp130受體，激活JAK2/STAT3促進(jìn)REG3A分泌。REG3A結(jié)合膜受體 EGFR也可通過該通路促進(jìn)自分泌，形成JAK2/STAT3/REG3A環(huán)路。深入研究發(fā)現(xiàn)在IL-6誘導(dǎo)的炎癥環(huán)境中REG3A體內(nèi)和體外促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞惡性增殖。同時通過皮下移植瘤及胰腺原位癌模型研究發(fā)現(xiàn)Reg3g促進(jìn)胰腺癌形成的免疫學(xué)機(jī)制，初步明確，Reg3g激活DCs細(xì)胞中STAT3信號通路，抑制DCs成熟及對CD8+T細(xì)胞抗原提呈能力，上調(diào)T

10、regs數(shù)量，協(xié)同Th2型細(xì)胞因子等免疫抑制發(fā)揮抑制腫瘤免疫應(yīng)答。隨后，封閉CD8+T細(xì)胞，明確Reg3g抑制CD8+T細(xì)胞中STAT3信號通路，抑制CD8+T對腫瘤的殺傷作用。同時Reg3g活化腫瘤組織中STAT3信號通路，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。
　　創(chuàng)新點(diǎn)：1.本研究首次闡明在IL-6介導(dǎo)的炎癥環(huán)境中REG3A激活REG3A-JAK2/STAT3正反饋環(huán)路，促進(jìn)腫瘤的形成。
　　2.本研究首次采用原位胰腺移植瘤模型，明確