B7-H1對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖能力影響和分子機(jī)制研究.pdf

1、胰腺癌由于早期轉(zhuǎn)移、高侵襲性及缺少有效的治療措施，是一個(gè)高死亡率和短暫生存期的疾病。完全的腫瘤外科切除仍然是主要的有效治療措施，化療藥物對(duì)這一進(jìn)展期疾病效果有限。當(dāng)前研究致力于闡明胰腺癌的發(fā)病機(jī)理，探索早期診斷方法，尋找有治療價(jià)值的藥物靶點(diǎn)等。
　　B7-H1(CD274，PD-L1)是在1999年首先發(fā)現(xiàn)，屬于B7共刺激分子家族中的一種細(xì)胞表面糖蛋白。許多研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)B7-H1在人類各系統(tǒng)腫瘤中廣泛分布，并與不良預(yù)后和腫瘤惡性程

2、度緊密相關(guān)。B7-H1蛋白的主要功能是參與腫瘤細(xì)胞對(duì)腫瘤抗原特異性T淋巴細(xì)胞的免疫逃逸過(guò)程，它可以與T細(xì)胞上的PD-1受體或其它受體結(jié)合從而誘導(dǎo)T細(xì)胞失活或凋亡、抑制T細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞因子如IL-2等的釋放，從而使腫瘤細(xì)胞免于受到T淋巴細(xì)胞的攻擊而得以存活。B7-H1在很多腫瘤組織中高表達(dá)，并與臨床分期病理分型相關(guān)。此外近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)B7-H1分子不但介導(dǎo)對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸反應(yīng)，而且在腫瘤中的異常表達(dá)會(huì)直接影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)活性

3、。本課題擬重點(diǎn)研究B7-H1在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制，探討B(tài)7-H1是否直接影響胰腺癌細(xì)胞的生物學(xué)活性，參與胰腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等過(guò)程，為臨床胰腺癌的分子靶向治療提供新的靶點(diǎn)。
　　目的
　　檢測(cè)B7-H1蛋白在胰腺導(dǎo)管腺癌標(biāo)本中的表達(dá)。分別構(gòu)建B7-H1過(guò)表達(dá)和RNA干擾的慢病毒載體，研究B7-H1基因表達(dá)對(duì)人胰腺癌細(xì)胞增殖及遷移能力的影響。
　　方法
　　1.應(yīng)用免疫組化方法(IHC)測(cè)定30例胰腺導(dǎo)管

4、腺癌標(biāo)本中B7-H1蛋白表達(dá)情況。
　　2.PCR擴(kuò)增B7-H1基因的完整開放閱讀框(open reading frame，ORF)片段，設(shè)計(jì)并合成針對(duì)B7-H1基因的RNAi靶向單鏈片段，通過(guò)慢病毒載體包裝系統(tǒng)，對(duì)以上2種片段進(jìn)行慢病毒顆粒包裝;再用病毒感染不同的胰腺癌細(xì)胞株，獲得穩(wěn)定高表達(dá)B7-H1蛋白(B7-H1-ORF)和B7-H1表達(dá)抑制(B7-H1-RNAi)的細(xì)胞株。
　　3.體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn):分別檢測(cè)不同細(xì)胞株的

5、生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞周期、克隆形成能力的變化，Western blotting法分析細(xì)胞周期相關(guān)蛋白及可能的信號(hào)分子變化，RT-PCR檢測(cè)B7-H1過(guò)表達(dá)細(xì)胞株上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)基因變化。
　　采用SPSS17.0軟件單因素方差分析(ANVOA)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示，兩組之間的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用x2檢驗(yàn)及Spearman等級(jí)相關(guān)分析，P＜0.05表示顯著差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果<

6、br>　　1.免疫組化分析顯示（62.4±9.1）％的胰腺導(dǎo)管腺癌標(biāo)本中表達(dá)B7-H1蛋白，且主要定位于細(xì)胞質(zhì)。B7-H1蛋白在胰腺導(dǎo)管腺癌標(biāo)本中表達(dá)高于胰腺正常組織。
　　2.成功構(gòu)建B7-H1-ORF和B7-H1-RNAi慢病毒表達(dá)載體，并獲得穩(wěn)定高表達(dá)B7-H1的PANC-1細(xì)胞株和B7-H1表達(dá)抑制的BxPC-3細(xì)胞株。
　　3.與對(duì)照組細(xì)胞相比，B7-H1-ORF轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖速度和克隆形成能力均顯著加快，而B7-

7、H1-RNAi轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞增殖速度和克隆形成能力顯著下降;細(xì)胞周期檢測(cè)進(jìn)一步驗(yàn)證了這一結(jié)果。B7-H1-ORF轉(zhuǎn)染組CDK4、CDK6、cyclinD1、p-Rb、p-JNK表達(dá)水平相比對(duì)照組有上調(diào)，B7-H1-RNAi轉(zhuǎn)染組比對(duì)照組則出現(xiàn)下調(diào)。
　　4.B7-H1-ORF轉(zhuǎn)染組細(xì)胞EMT相關(guān)基因檢測(cè)比對(duì)照組無(wú)明顯差異。
　　結(jié)論
　　B7-H1蛋白在胰腺導(dǎo)管腺癌標(biāo)本中表達(dá)高于胰腺正常組織。提示B7-H1可能參與胰腺癌

8、發(fā)生發(fā)展的病理過(guò)程。體外實(shí)驗(yàn)中，高表達(dá)B7-H1可以促進(jìn)PANC-1細(xì)胞的增殖，而在B7-H1表達(dá)較高的BxPC-3細(xì)胞中降低B7-H1表達(dá)則抑制了細(xì)胞增殖。證明了B7-H1在胰腺癌中促進(jìn)腫瘤發(fā)展的作用。并且這種影響可能是通過(guò)JNK通路調(diào)控的。B7-H1的過(guò)表達(dá)沒(méi)有引起胰腺癌細(xì)胞出現(xiàn)EMT現(xiàn)象。本研究提示B7-H1的異常表達(dá)可能促進(jìn)胰腺癌實(shí)體腫瘤的生長(zhǎng)，B7-H1可能成為胰腺癌治療有效靶點(diǎn)，并為后續(xù)優(yōu)化針對(duì)B7-H1的臨床試驗(yàn)提供理論基