Gankyrin促進(jìn)胰腺癌增殖能力的機(jī)制研究.pdf

1、【背景】
　　胰腺癌是一種惡性程度高、進(jìn)展迅速和預(yù)后極差的消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤。盡管新輔助化療、外科手術(shù)技術(shù)、圍手術(shù)期護(hù)理技術(shù)已取得顯著進(jìn)步，但是胰腺癌的預(yù)后并沒有明顯改善。在過去的幾十年中，科研工作者一直致力于尋找胰腺癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)基因和分子通路，對(duì)于闡明胰腺癌發(fā)病機(jī)制、改善胰腺癌患者生存與預(yù)后具有重要意義。
　　Gankyrin是在肝癌中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新的癌基因，定位于人類X染色體22區(qū)3帶，編碼一個(gè)包含七個(gè)錨蛋白重復(fù)序列

2、的癌蛋白，其在所有物種中均高度保守。Gankyrin蛋白在正常消化系統(tǒng)器官呈陰性或僅有微弱表達(dá)，但是在癌變組織如肝細(xì)胞癌、食管鱗狀細(xì)胞癌、結(jié)腸癌中異常高表達(dá)。Gankyrin是26S蛋白酶體的一個(gè)亞基，能與E3泛素連接酶MDM2結(jié)合，促進(jìn)泛素化，負(fù)性調(diào)節(jié)P53基因；Gankyrin還可以與Rb結(jié)合，促進(jìn)Rb蛋白磷酸化和降解，同時(shí)，Gankyrin還能與周期素依賴性蛋白激酶4結(jié)合，形成gankyrin-CDK4-cyclinD復(fù)合物，間接

3、活化CDK4，使Rb蛋白高度磷酸化，增強(qiáng)E2F轉(zhuǎn)錄子活性，促進(jìn)細(xì)胞周期G1/S進(jìn)展，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生和增殖。既往研究顯示，Gankyrin的異常高表達(dá)在肝癌發(fā)生早期發(fā)揮著重要的作用，并與肝細(xì)胞細(xì)胞周期進(jìn)展和暴發(fā)性肝功能衰竭中的肝再生密切相關(guān)。在食管鱗狀細(xì)胞癌，Gankyrin的高表達(dá)預(yù)示著預(yù)后不良。我們實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)Gankyrin的高表達(dá)與結(jié)直腸癌的惡性表型正相關(guān)。這些結(jié)果提示Gankyrin可能是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的重要相關(guān)分子

4、。但其在胰腺癌組織的分布及其作用目前未見報(bào)道。
　　【目的】
　　1.檢測(cè)Gankyrin在胰腺癌組織和胰腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)及意義。
　　2.觀察Gankyrin對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖能力的影響。
　　3.探討Gankyrin影響胰腺癌細(xì)胞增殖的可能分子機(jī)制。
　　【方法】
　　1.免疫組化和Westernblot法檢測(cè)Gankyrin在胰腺癌和癌旁正常組織中的表達(dá)，并分析其臨床病理學(xué)意義。
　　2.

5、Real-timePCR和Westernblot檢測(cè)胰腺癌細(xì)胞系（SW1990、PC-2、BxPC-3和PANC-1）中Gankyrin的mRNA和蛋白的表達(dá)。
　　3.脂質(zhì)體法將Gankyrin特異siRNA載體轉(zhuǎn)染入胰腺癌SW1990細(xì)胞，將Gankyrin基因的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入PC-2細(xì)胞，G418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆。
　　4.MTT實(shí)驗(yàn)、軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)等觀察Gankyrin對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞體外生長(zhǎng)

6、增殖能力的影響。
　　5.裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Gankyrin表達(dá)改變后，胰腺癌細(xì)胞的體內(nèi)成瘤能力的變化。
　　6.Westernblot檢測(cè)上述轉(zhuǎn)染細(xì)胞中細(xì)胞周期相關(guān)分子cyclinA、cyclinD1、cyclinE、CDK2、CDK4、PCNA、Rb、p-Rb、p27和p53的變化。
　　【結(jié)果】
　　1.Gankyrin在胰腺癌組織和胰腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)。
　　Gankyrin在癌旁組織的表達(dá)陽(yáng)性率為7

7、.8％(5/64)，而在胰腺癌組織的表達(dá)陽(yáng)性率71.9％(46/64)，明顯高于癌旁組織（P<0.01）。在癌組織中，低分化級(jí)別組Gankyrin的表達(dá)明顯高于高分化級(jí)別組（P<0.05），TNM分期中低級(jí)別組Gankyrin的表達(dá)明顯高于高級(jí)別組（P<0.05），Gankyrin的過表達(dá)與腫瘤大小密切相關(guān)（P<0.05）。各胰腺癌細(xì)胞系（SW1990、PC-2、BxPC-3和PANC-1）均有表達(dá)Gankyrin，其中SW1990表達(dá)

8、水平最高，PC-2最低。
　　2.Gankyrin對(duì)胰腺癌細(xì)胞體內(nèi)外生長(zhǎng)增殖能力的影響。
　　轉(zhuǎn)染Gankyrin正義載體的胰腺癌PC-2細(xì)胞較親本細(xì)胞，生長(zhǎng)速度顯著加快，G1期進(jìn)入S期的細(xì)胞比例增加，單細(xì)胞集落形成能力及裸鼠體內(nèi)成瘤能力顯著增強(qiáng)；而轉(zhuǎn)染Gankyrin特異siRNA的胰腺癌SW1990細(xì)胞較親本細(xì)胞，生長(zhǎng)顯著受到抑制，G1期進(jìn)入S期的細(xì)胞比例明顯降低，單細(xì)胞集落形成能力減弱，裸鼠體內(nèi)成瘤能力也顯著減弱。

9、r>　　3.Gankyrin對(duì)參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的相關(guān)分子的影響。
　　轉(zhuǎn)染Gankyrin正義載體的PC-2細(xì)胞中，參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的相關(guān)分子cyclinD1、cyclinE、cyclinA、CDK2、CDK4、PCNA和p-Rb表達(dá)上調(diào)，p53、p27和Rb表達(dá)受到抑制。而siRNA下調(diào)SW1990細(xì)胞Gankyrin的表達(dá)后，cyclinD1、cyclinE、cyclinA、CDK2、CDK4、PCNA和p-Rb表達(dá)亦顯著下調(diào)