Hsp60 通過提升線粒體功能促進(jìn)胰腺癌發(fā)生的機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　胰腺癌(Pancreatic cancer)是常見的消化道惡性腫瘤之一，常見組織類型為胰腺導(dǎo)管細(xì)胞癌（PDAC），據(jù)最新數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示2015年我國(guó)新發(fā)胰腺癌病達(dá)9萬例，居消化道惡性腫瘤發(fā)病率第五位，惡性腫瘤死因的第五位[1]。因?yàn)槿狈υ缙谠\斷，其5年生存率僅為4％，是美國(guó)第四大致死性腫瘤[2-3]。因此對(duì)于胰腺癌發(fā)生的機(jī)制研究顯得至關(guān)重要。腫瘤是一類復(fù)雜性疾病，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中，腫瘤逐步獲得了包括6個(gè)生物學(xué)能力在內(nèi)

2、的標(biāo)志性特征及潛在兩個(gè)新發(fā)現(xiàn)的標(biāo)志性特征，其中包括細(xì)胞能量代謝的重編程[4]。當(dāng)然亦有研究表明線粒體氧化磷酸化（OXPHOS）功能對(duì)于腫瘤進(jìn)程起著重要作用,該觀點(diǎn)認(rèn)為線粒體功能改變的逆向信號(hào)分子（如ROS,ATP等）能逆向調(diào)控核基因表達(dá)下的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[5]。眾所周知，線粒體作為細(xì)胞能量代謝中心，其功能的改變必然會(huì)參與到腫瘤細(xì)胞能量代謝的重編程的過程當(dāng)中，而線粒體功能的維持依賴于其自身一套獨(dú)立的質(zhì)量控制系統(tǒng)[6]

3、。本課題以質(zhì)量控制系統(tǒng)中一重要蛋白分子Hsp60作為研究對(duì)象，通過研究Hsp60在胰腺癌發(fā)生過程中的作用及其機(jī)制，繼而了解線粒體功能改變與胰腺癌發(fā)生的作用機(jī)制。因此本課題首先從胰腺癌組織以及各胰腺癌細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)Hsp60蛋白呈現(xiàn)高表達(dá)水平，隨后通過在敲低Hsp60蛋白表達(dá)的胰腺癌細(xì)胞模型中驗(yàn)證線粒體功能的變化，我們發(fā)現(xiàn)低表達(dá)Hsp60后細(xì)胞線粒體氧化磷酸化（OXPHOS）水平顯著降低，同時(shí)癌細(xì)胞增殖遷移能力等顯著降低。隨后我們發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證

4、了OXPHOS水平的降低導(dǎo)致Erk1/2磷酸化水平的降低，而這一磷酸化的降低是由ATP生成水平降低直接導(dǎo)致。這一結(jié)果使得我們認(rèn)為線粒體OXPHOS功能的改變逆向調(diào)控特定核基因信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白表達(dá)，繼而影響腫瘤的發(fā)生。這一發(fā)現(xiàn)對(duì)于明確OXPHOS水平與胰腺癌發(fā)生的確切關(guān)系顯得尤為重要，同時(shí)對(duì)于Hsp60蛋白作為一潛在胰腺癌生物學(xué)標(biāo)志物提供了研究基礎(chǔ)。
　　目的:
　　1.為了研究線粒體OXPHOS與胰腺癌發(fā)生的關(guān)系，我們首先分析了

5、影響氧化磷酸化水平至關(guān)重要的蛋白分子Hsp60與胰腺癌的關(guān)系，從組織水平和細(xì)胞水平兩個(gè)方面對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　2.為了明確Hsp60是否確實(shí)影響胰腺癌發(fā)生進(jìn)程，我們分析了Hsp60蛋白敲低的胰腺癌細(xì)胞（Panc-1）其在體內(nèi)、體外生物學(xué)功能的變化。
　　3.為明確Hsp60是通過何種機(jī)制影響胰腺癌的發(fā)生，我們分析了Hsp60蛋白敲低的胰腺癌細(xì)胞系(Panc-1)中OXPHOS的水平。一方面確定Hsp60表達(dá)與線粒體OXPHO

6、S水平的確切關(guān)系，另一方面探討是否通過OXPHOS水平的改變影響胰腺癌的發(fā)生。
　　4.為進(jìn)一步明確 OXPHOS水平與胰腺癌發(fā)生關(guān)系，我們對(duì)正常胰腺及癌細(xì)胞的OXPHOS水平進(jìn)行檢測(cè)。
　　5.為了明確由Hsp60導(dǎo)致的OXPHOS水平的變化是通過何種逆向調(diào)控機(jī)制影響胰腺癌的發(fā)生，我們對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白表達(dá)水平進(jìn)行分析，從中發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)信號(hào)蛋白，尋找可能致癌機(jī)制。
　　6.為明確線粒體OXPHOS水

7、平降低導(dǎo)致該通路蛋白表達(dá)差異，我們通過EB誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞（Panc-1）OXPHOS缺陷模型，檢測(cè)該通路蛋白的變化。
　　7.為進(jìn)一步明確OXPHOS何種逆向信號(hào)分子（ROS,ATP等）的改變逆向調(diào)控了該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白表達(dá)，我們通過各復(fù)合體抑（Roteone,Oligomycin,FCCP）處理胰腺癌細(xì)胞（Panc-1）及其給予ATP，NAC處理Hsp60蛋白敲低的胰腺癌細(xì)胞（Panc-1），檢測(cè)該通路蛋白表達(dá)水平變化。

8、　　8.為進(jìn)一步驗(yàn)證差異表達(dá)信號(hào)分子是否參與胰腺癌發(fā)生機(jī)制中，我們對(duì)該信號(hào)分子在正常胰腺及癌細(xì)胞中表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。
　　方法:
　　1.分別通過免疫組織化學(xué)技術(shù)和 SDS-PAGE技術(shù)檢測(cè)胰腺癌組織以及癌旁組織中Hsp60蛋白表達(dá)水平，以明確Hsp60表達(dá)水平與胰腺癌發(fā)生的關(guān)系。
　　2.通過SDS-PAGE技術(shù)檢測(cè)人源胰腺正常細(xì)胞（HPDE6c7）以及細(xì)胞胰腺癌細(xì)胞系（SW1990,Patu-8988,Panc-1

9、）中Hsp60蛋白的表達(dá)水平。
　　3.選取一株人源胰腺癌細(xì)胞（Panc-1），通過RNAi干擾技術(shù)對(duì)其Hsp60蛋白進(jìn)行敲低表達(dá)。
　　4.通過 CCK-8細(xì)胞活性、細(xì)胞平板克隆、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，Transwell小室遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)等體外實(shí)驗(yàn)以及裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Hsp60蛋白敲低后對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響進(jìn)行分析。
　　5.通過BN-PAGE技術(shù)、氧耗能力（OCR）檢測(cè)技術(shù)、ATP生成檢測(cè)技術(shù)、ROS

10、生成對(duì)Hsp60蛋白敲低的Panc-1細(xì)胞OXPHOS水平進(jìn)行檢測(cè)。
　　6.通過BN-PAGE技術(shù)和氧耗能力（OCR）檢測(cè)技術(shù)對(duì)人源胰腺正常細(xì)胞（HPDE6c7）以及胰腺癌細(xì)胞系（SW1990,Patu-8988,Panc-1）的超級(jí)復(fù)合體表達(dá)情況和氧耗能力進(jìn)行檢測(cè)。
　　7.通過SDS-PAGE技術(shù)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖重要的信號(hào)通路蛋白（P38,JNK,Erk1/2, AMPK,AKT等）在Hsp60蛋白敲低的Panc-1細(xì)胞

11、中表達(dá)水平進(jìn)行分析
　　8.通過給予EB藥物不同時(shí)間的處理，利用SDS-PAGE檢測(cè)上述差異信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平。
　　9.通過SDS-PAGE技術(shù)，利用Roteone,Oligomycin,FCCP藥物處理Panc-1細(xì)胞以及給予ATP和NAC處理Hsp60蛋白敲低的Panc-1細(xì)胞，檢測(cè)上述差異信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平。
　　10.通過SDS-PAGE技術(shù)，檢測(cè)各人源胰腺正常細(xì)胞（HPDE6c7）以及細(xì)胞胰腺癌細(xì)胞系（

12、SW1990,Patu-8988,Panc-1）中上述差異信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平。
　　11.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：應(yīng)用SPSS19.0軟件分析細(xì)胞之間復(fù)合體表達(dá)量和線粒體功能的差異。
　　結(jié)果:
　　1.通過免疫組織化學(xué)技術(shù)和SDS-PAGE檢測(cè)胰腺癌組織以及癌旁組織Hsp60蛋白表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)Hsp60蛋白表達(dá)在胰腺癌組織中呈高表達(dá)水平，具有顯著性差異。
　　2.查閱文獻(xiàn)，確定本課題所用人源胰腺正常及癌細(xì)胞(HPDE6c

13、7,SW1990,Patu-8988,Panc-1）
　　3.通過 SDS-PAGE技術(shù)檢測(cè)到在胰腺癌細(xì)胞系中 Hsp60蛋白表達(dá)水平呈高表達(dá)水平
　　4.選取其中一株胰腺癌細(xì)胞Panc-1作為后續(xù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞模型，將其Hsp60蛋白敲低后，發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞在體外生長(zhǎng)增殖能力、遷移和侵襲能力均顯著下降，在體內(nèi)成瘤能力減弱。
　　5.通過BN/SDS-PAGE技術(shù)、氧耗能力檢測(cè)、ATP及ROS生成實(shí)驗(yàn)對(duì)其OXPHOS水平進(jìn)行

14、檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)超級(jí)復(fù)合體表達(dá)水平下降，OCR值下降，ATP生成能力下降，ROS生成增高。
　　6.通過 BN/SDS-PAGE技術(shù)和氧耗能力檢測(cè)正常胰腺細(xì)胞和癌細(xì)胞的OXPHOS水平，發(fā)現(xiàn)在胰腺癌細(xì)胞系中超級(jí)復(fù)合體表達(dá)量以及OCR值均較正常胰腺細(xì)胞高，具有顯著性差異。
　　7.我們對(duì)一系列信號(hào)分子（P38,JNK,Erk1/2,AMPKa,AKT等）進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明Panc-1細(xì)胞Hsp60蛋白敲低后，其Erk1/2磷酸化水平

15、降低，而其他信號(hào)分子卻并未明顯改變。
　　8.在給予EB藥物處理Panc-1細(xì)胞后，隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，Erk1/2磷酸化水平逐步降低。
　　9.給予Rotenone，Oligomycin藥物處理Panc-1細(xì)胞后，其Erk1/2磷酸化水平降低，而FCCP處理后磷酸化水平未發(fā)生明顯改變，同時(shí)給予Oligomycin和FCCP處理后其磷酸化水平也下降。
　　10.給予ATP處理Hsp60蛋白敲低的Panc-1細(xì)胞后，其Er

16、k1/2磷酸化增高，然而NAC處理卻未發(fā)生明顯變化。
　　11.通過SDS-PAGE檢測(cè)HPDE6c7,SW1990,Patu-8988,Panc-1細(xì)胞中Erk1/2磷酸化水平，發(fā)現(xiàn)在癌細(xì)胞系中，Erk1/2磷酸化水平增高。
　　結(jié)論:
　　1.由免疫組織化學(xué)技術(shù)和SDS-PAGE在胰腺癌組織中檢測(cè)Hsp60蛋白高表達(dá)水平表明 Hsp60蛋白參與胰腺癌發(fā)生的進(jìn)程當(dāng)中，而在各人源胰腺癌細(xì)胞系中Hsp60高表達(dá)水平則進(jìn)一

17、步表明該結(jié)論。
　　2.將Hsp60蛋白敲低后Panc-1細(xì)胞，其細(xì)胞生長(zhǎng)增殖能力、遷移和侵襲能力均下降，癌細(xì)胞生物學(xué)特性降低，說明Hsp60對(duì)促進(jìn)胰腺癌發(fā)生具有直接關(guān)系。
　　3.在Hsp60蛋白敲低的Panc-1細(xì)胞中，其超級(jí)復(fù)合體表達(dá)水平下降，OCR值下降，ATP生成能力下降，ROS生成增高，說明Hsp60蛋白對(duì)于維持線粒體OXPHOS功能起著重要作用。
　　4.根據(jù) BN/SDS-PAGE技術(shù)和氧耗能力檢測(cè)到

18、HPDE6c7，SW1990，Patu-8988， Panc-1細(xì)胞中癌細(xì)胞系的超級(jí)復(fù)合體表達(dá)量以及 OCR值均較正常胰腺細(xì)胞高，表明胰腺癌細(xì)胞較高的線粒體OXPHOS水平促進(jìn)了胰腺癌的發(fā)生。
　　5.通過對(duì)生長(zhǎng)增殖信號(hào)通路蛋白的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在Hsp60蛋白敲低的Panc-1細(xì)胞中，Erk1/2磷酸化水平下降，同時(shí)在給予不同時(shí)間EB處理Panc-1細(xì)胞后， Erk1/2磷酸化水平也發(fā)生下降，該結(jié)果表明線粒體 OXPHOS水平的下降或

19、缺陷介導(dǎo)Erk1/2磷酸化水平下降導(dǎo)致癌細(xì)胞生物學(xué)特性降低。與此同時(shí)在癌細(xì)胞系中Erk1/2磷酸化水平升高也驗(yàn)證了這一結(jié)論。
　　6.在給予Rotene，Oligomycin藥物處理Panc-1細(xì)胞后，其Erk1/2磷酸化水平降低，而FCCP處理后磷酸化水平未發(fā)生明顯改變，同時(shí)給予Oligomycin和FCCP處理后其磷酸化水平也下降。該結(jié)果說明由OXPHOS水平降低引起Erk1/2磷酸化降低是由于ATP生成降低所導(dǎo)致，而給予AT