番茄hsp108.6、hsp60αβ亞基的基因克隆及表達(dá)分析

1、Y 7 6 4 5 3 4侈蓀街箍史學(xué)碩士學(xué)位論文論文題目 番茄H S P l 0 8 ．6 、H S P 6 0 口／蘆亞基的基因克隆及表達(dá)分析學(xué)科專業(yè)名稱 植物學(xué)申請(qǐng)人姓名 孫穎指導(dǎo)教師 劉箭教授論文提交時(shí)間 2 0 0 5 年0 4 月1 5 日朱麓騮零 勿墨定t } 旅‘、山東師范大學(xué)碩士學(xué)位論文番茄刪口& 6 、H S P 6 0 a ／, a 亞基的基因克隆及表達(dá)分析孫穎( 山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院)摘要目前所知，所

2、有的植物、動(dòng)物、細(xì)菌等微生物在超過(guò)最適生長(zhǎng)溫度時(shí)都會(huì)產(chǎn)生一系列蛋白( 熱休克蛋白) 。這些蛋白具有分子伴侶的功能，防止失活蛋白聚集成團(tuán)，輔助新生多肽鏈正確折疊，或者幫助溶解聚集失活的蛋白。熱激蛋白可以分為幾個(gè)家族：H S P l 0 0 ，H S P 9 0 ，H S P 7 0 ，H S P 6 0 ，H S P 4 0 ，s H S P 。在細(xì)菌、酵母和植物體內(nèi)C I p B 蛋白可以依靠A T P 溶解熱激反應(yīng)中細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)形

3、成的蛋白聚集物。C p n 6 0 0 t S P 6 0 ) 葉綠體÷p n 6 0 主要功能包括：葉綠體蛋白的穿膜運(yùn)輸，葉綠體分化和果實(shí)成熟。本實(shí)驗(yàn)從利用E S T 方法對(duì)熱激制備的番茄c D N A 文庫(kù)進(jìn)行了超長(zhǎng)基因克隆的篩選，獲得了五個(gè)基因全序：c h a p e r o n i n - 6 0a l p h as u b u n i t ；c h a l x a ' o n i n ．6 0b e t a

4、s u b u n i t ：C l p Bh e a ts h o c kp r o t e i n ；T P R - r e p e a tp r o t e i n ；h e a ts h o c kp r o t e i n8 3 ：p e p t i d y l p r o l y li s o m e r a s e ．。選取H S P l 0 8 ．6 和c h a p e r o n i n 一6 0b e t a s

5、u b u n i t ，研究了它們的生化特性。葉綠體H S P l 0 8 ．6 基因全長(zhǎng)3 1 4 4 b p ，共編碼9 8 4 個(gè)氨基酸。通過(guò)對(duì)C l p B 的序列特征及同源性的分析表明，它與利馬豆的葉綠體C l p B 及擬南芥H S P l 0 9 序列高度相似，具有一個(gè)預(yù)測(cè)的葉綠體信號(hào)肽。以G S T - H S P l 0 8 ．6 ．融合蛋白為抗原免疫家兔，制備了H S P l 0 8 ．6 抗體，首次在分子水平上證

6、明了這個(gè)基因的葉綠體定位。S o u t h e r n 雜交顯示，葉綠體H S P l 0 8 ．6 在番茄基因組中有兩個(gè)以上的拷貝。N o r t h e r n雜交顯示，H S P l 0 8 ．6 在番茄葉片中是誘導(dǎo)型表達(dá)的，3 2 0 C 時(shí)即出現(xiàn)表達(dá)，而且表達(dá)量隨溫度升高而增加。W e s t e r n 結(jié)果與N o r t h e r n 結(jié)果一致。果實(shí)蛋白W e s t e r n 分析表明，在番茄果實(shí)中是H S P

7、l 0 8 ．6 組成型表達(dá)的，隨溫度升高表達(dá)量增加。番茄葉綠體H S P 6 0 a 亞基序列c D N A 片段全長(zhǎng)2 1 1 7 b p ，共編碼5 7 9 個(gè)氨基酸。葉綠體H S P 6 0B 亞基c D N A 片段全長(zhǎng)2 2 0 7 b p ，編碼5 0 9 個(gè)氨基酸。以G S T - H S P 6 0 t 3亞基融合蛋白為抗原免疫家兔，制備了H S l ' 6 0 p 亞基的特異性抗體。通過(guò)W e s t e r

8、 n 比較了葉綠體H S P 6 0 p 亞基、H S P l 0 8 ．6 和s H S P 的表達(dá)差異：H S P 6 0 是組成型表達(dá)；H S P l 0 $ ．6 在常溫下不表達(dá)，3 2 0 c 時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)，3 8 。c 達(dá)到最高峰，4 0 0 C 、4 2 0 c 略有下降，說(shuō)明該基因的表達(dá)受熱誘導(dǎo)：s H S P 在常溫下不表達(dá)，3 6 0 C 出現(xiàn)表達(dá)。因此熱激蛋白存在多種表達(dá)模式。關(guān)鍵詞：熱激蛋白、C I p B 、H