胞外HSP60參與介導缺血心肌炎癥反應的研究.pdf

1、熱休克蛋白60(heat shock protein，HSP60)是HSP家族的成員之一，生理狀態(tài)下主要位于線粒體內，小部分位于胞漿。我們前期報道，心肌缺血時HSP60異常轉位進入心肌細胞胞膜中并且出胞，異常出現(xiàn)在實驗動物血清中。文獻報道，外源性HSP60能夠激活天然免疫細胞所表達的toll樣受體(toll-like receptor, TLR)2和4，引起致炎細胞因子產生。TLR2和TLR4均為分布于細胞膜中的跨膜受體，配體結合區(qū)位于

2、胞外，它們不僅在免疫細胞表達，也在心肌細胞及其他類型細胞表達。生理狀態(tài)下，HSP60位于細胞內，不具備激活TLR2/4的條件;當心肌缺血時，內源性HSP60異常出現(xiàn)在胞外（例如血清），我們推測其有可能激活心肌細胞TLR2和/或TLR4受體從而誘導炎癥反應，本課題檢驗了這一假設。為了驗證該假設，本課題在正常培養(yǎng)的H9c2心肌細胞，研究了外源性HSP60的致炎作用以及TLR2/4信號機制;并且在H9c2心肌細胞模擬缺血模型以及整體大鼠心肌缺

3、血模型，研究了缺血時異常出現(xiàn)在胞外的內源性HSP60對缺血所致心肌炎癥反應的介導作用以及TLR2/4信號機制。
　　 [研究方法]
　　 培養(yǎng)細胞實驗:按常規(guī)培養(yǎng)H9c2心肌細胞系，當細胞融合達80％時，給予外源性HSP60孵育，或者以“無血清+低糖+1％低氧”進行模擬缺血培養(yǎng)。ELISA法檢測細胞培液上清HSP60含量，判斷模擬缺血是否引起HSP60出胞;real-time RT-PCR法檢測細胞TNF-α和IL-6

4、mRNA含量，結合ELISA法檢測培液上清TNF-α和IL-6含量，從而反映炎癥反應情況。為了研究胞外HSP60引起炎癥反應的信號機制，我們進行了三項檢測:1)免疫共沉淀法檢測HSP60與TLR2/4以及TLR2/4與其下游接頭蛋白MyD88/Trif的結合情況;2）Western blot法檢測TLR2/4下游信號分子p38、JNK和NF-κB的激活情況;3）利用藥物阻斷TLR2/4、MyD88、p38、JNK和NF-κB等信號分子，

5、觀察對外源性HSP60以及模擬缺血所致炎癥反應的干預作用。
　　 整體動物實驗:結扎冠狀動脈左前降支(left anterior descending coronary artery,LAD)4 h制備整體大鼠心肌缺血模型。ELISA法檢測血清HSP60含量以反應胞外HSP60含量;real-time RT-PCR法檢測心肌TNF-a和IL-6 mRNA表達水平，ELISA法檢測血清TNF-α和IL-6含量，以反應心肌炎癥反應情

6、況。為了研究胞外HSP60是否參與介導缺血心肌炎癥反應，用免疫共沉淀法檢測了心肌組織中HSP60與TLR2/4及其下游接頭蛋白MyD88/Trif的結合情況，并且用抗體中和血清HSP60（胞外HSP60），觀察能否減輕缺血心肌炎癥反應。
　　 [結果]
　　 1.在培養(yǎng)的H9c2心肌細胞，外源性HSP60經TLR4-MyD88-p38/NFkB通路引起炎性細胞因子產生
　　 在常規(guī)培養(yǎng)的H9c2心肌細胞，外源性H

7、SP60能夠顯著增加炎性因子TNF-α和IL-6的表達和釋放。HSP60孵育后1h即有顯著增加，孵育后6h后達到峰值。在孵育6h條件下，HSP605μg/mL處理組和HSP601μg/mL處理組TNF-α和IL-6表達和釋放量均顯著高于對照組，且前者更高。
　　 取外源性HSP60（1μg/mL）孵育6h后的細胞裂解液，用HSP60抗體和TLR4抗體分別進行免疫共沉淀，結果顯示HSP60與TLR4有明顯結合，但與TLR2基本沒有

8、結合;同時，TLR4與MyD88而不與Trif結合。在對照組細胞中，TLR4與MyD88有結合;在HSP60處理組細胞中，TLR4與MyD88結合明顯增多。
　　 Western blot結果顯示，外源性HSP60（1μg/mL）使得TLR4-MyD88下游的激酶p38和JNK均發(fā)生磷酸化激活，兩者在HSP60孵育后1h即激活（P＜0.05），6～12h達到峰值（P＜0.01）。免疫熒光染色和Western blot檢測表明，外

9、源性HSP60（1μg/mL）使得TLR4-MyD88下游的轉錄因子NF-κB的亞單位p65發(fā)生核轉位，表明NF-κB被激活。
　　 以外源性HSP60（1μg/mL）孵育6h誘導炎癥反應，TLR4 siRNA(100 nM)、TLR4抗體（5μg/mL）、MyD88抑制性多肽（100μM）、p38抑制劑SB203580（20μM）和NF-κB抑制劑PDTC(100μM)均能夠顯著抑制HSP60所致p38和JNK激活以及炎性細胞

10、因子產生;但TLR2抗體（5μg/mL）和JNK抑制劑SP600125（20μM）無顯著作用;陰性對照siRNA、對照抗體IgG和MyD88對照多肽也無顯著作用。
　　 以上結果表明，外源性HSP60具有誘導心肌細胞產生炎性細胞因子的效應，該效應由TLR4-MyD88-p38/NFkB通路所介導，而與TLR2和Trif無關。
　　 2.在模擬缺血培養(yǎng)的H9c2心肌細胞，內源性HSP60異常出現(xiàn)在胞外，并經TLR4-MyD

11、88-p38/NFkB通路參與介導缺血所致炎癥反應
　　 H9c2細胞模擬缺血12h后，ELISA法檢測到培液上清HSP60含量為3.7±0.7 ng/mL，而對照組幾乎檢測不到，表明模擬缺血引起HSP60出現(xiàn)在胞外。免疫共沉淀法顯示，在模擬缺血處理的細胞中，HSP60與TLR4有大量結合，但與TLR2基本沒有結合;同時，TLR4與MyD88而不與Trif結合，模擬缺血組較對照組TLR4與MyD88結合量更高。
　　 在

12、模擬缺血的H9c2心肌細胞，Western blot結果顯示p38和JNK均發(fā)生磷酸化激活，用抗體中和胞外HSP60（anti-HSP60，10μg/mL）、用抗體封閉TLR4(anti-TLR4，5μg/mL)、或者用MyD88抑制性多肽（100μM）可顯著抑制模擬缺血引起的p38和JNK激活。
　　 Real-time RT-PCR及ELISA結果顯示模擬缺血引起TNF-α和IL-6表達和釋放均顯著增加，anti-HSP60

13、、anti-TLR4、TLR4 siRNA(100 nM)、MyD88抑制性多肽、p38抑制劑SB203580和NF-κB抑制劑PDTC能夠顯著抑制該效應，而JNK抑制劑SP600125無顯著作用。
　　 該結果表明，在H9c2細胞，模擬缺血引起內源性HSP60異常出現(xiàn)在胞外，胞外HSP60經TLR4-MyD88-p38/NFkB通路參與介導缺血所致炎癥反應。
　　 3.在整體大鼠心肌缺血模型，內源性HSP60異常出現(xiàn)在

14、循環(huán)中，并經TLR4-MyD88通路參與介導缺血心肌炎癥反應
　　 大鼠LAD結扎4h后，ELISA法檢測到血清HSP60含量為8.3±1.5 ng/mL，而假手術組基本檢測不到，表明缺血引起HSP60在胞外出現(xiàn)。免疫共沉淀法顯示，在缺血心肌中，HSP60與TLR4有大量結合，而與TLR2基本沒有結合;同時，TLR4與MyD88而不與Trif發(fā)生免疫共沉淀，缺血組較假手術組TLR4與MyD88結合量更高。
　　 LAD結

15、扎4h后，Western blot顯示p38和JNK均顯著激活。用抗體封閉血清中的HSP60（anti-HSP6020μg/kg，于LAD結扎15min前靜脈注射），能夠抑制p38和JNK激活，而對照抗體IgG沒有顯著效應。此外，心肌缺血引起TNF-α和IL-6產生和釋放量均顯著增加(P＜0.01)，anti-HSP60能夠抑制該效應，而對照抗體IgG沒有顯著效應。
　　 [結論]
　　 本課題研究表明，外源性HSP60