三疣梭子蟹熱休克蛋白HSP60和HSP90α的鹽度適應(yīng)相關(guān)性研究.pdf

1、三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)是我國(guó)沿海重要的經(jīng)濟(jì)蟹類,屬于廣鹽性水生物種,整個(gè)生活史都受到外界水環(huán)境鹽度的影響。從分子水平上了解三疣梭子蟹的滲透調(diào)節(jié)機(jī)制對(duì)三疣梭子蟹種質(zhì)資源的改良和水產(chǎn)養(yǎng)殖具有重要意義。熱休克蛋白(Heat shock protein,HSPs),是一組在生物進(jìn)化過(guò)程中高度保守的蛋白分子。當(dāng)機(jī)體受到逆境脅迫時(shí),細(xì)胞內(nèi)蛋白發(fā)生變性,而熱休克蛋白可以識(shí)別變性蛋白的疏水區(qū)域,協(xié)助變性蛋白重新恢

2、復(fù)天然構(gòu)象,提高細(xì)胞的脅迫耐受性。
　　熱休克蛋白是包括多種分子的蛋白家族。其中,HSP60和HSP90是兩類常見(jiàn)的熱休克蛋白分子。HSP60具有變性蛋白優(yōu)先結(jié)合能力,保護(hù)細(xì)胞免受逆境脅迫傷害;HSP90不僅能保護(hù)細(xì)胞不受脅迫傷害,還能與細(xì)胞功能蛋白特異結(jié)合,改變蛋白功能狀態(tài)。
　　利用簡(jiǎn)并引物,我們首次克隆得到三疣梭子蟹HSP60基因,其開(kāi)放閱讀框序列全長(zhǎng)為1734bp,編碼577個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)分子量為61.25kDa,等

3、電點(diǎn)為5.23。該氨基酸序列包含 HSP60家族信號(hào)位點(diǎn)以及特征基序。同源性分析與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)表明三疣梭子蟹 HSP60與已知的HSP60蛋白序列高度同源,與南美白對(duì)蝦Litopenaeus vannamei HSP60親緣關(guān)系最近,蛋白序列同源性為96％。
　　利用半定量RT-PCR檢測(cè)HSP60基因在肝、心、卵巢、腹肌、觸角腺、真皮、腸、附肢肌肉、鰓9種不同組織中的表達(dá)。結(jié)果表明:HSP60 mRNA在三疣梭子蟹各組織中均有表達(dá)

4、。正常鹽度條件下,HSP60在觸角腺和腸中表達(dá)量略高于其它組織。低鹽(10‰)脅迫12hr后,卵巢 HSP60 mRNA表達(dá)量明顯增加(p<0.01),約為脅迫前水平5.52倍,其次是鰓、心和附肢肌肉,分別為2.14、2.0、1.96倍,而觸角腺、腸表達(dá)量顯著減少(p<0.05),約為0.44、0.36倍;高鹽(40‰)脅迫12hr后,卵巢 HSP60 mRNA表達(dá)量顯著增加(p<0.001),約為脅迫前水平5.57倍,其次為真皮、鰓,

5、約為3.66、2.4倍。鹽度脅迫基本不影響肝、腹肌中的HSP60 mRNA表達(dá)。
　　利用半定量 RT-PCR技術(shù)檢測(cè)鹽度脅迫下,三疣梭子蟹鰓中 HSP60基因隨脅迫時(shí)間的表達(dá)情況。結(jié)果顯示:10‰低鹽脅迫24hr內(nèi),三疣梭子蟹 HSP60 mRNA表達(dá)量逐漸增加(p<0.05),約為脅迫前水平2.5倍;40‰高鹽脅迫12hr，HSP60 mRNA表達(dá)量迅速增加到最大值,約為4.26倍,隨后表達(dá)量減少。
　　利用wester

6、n blot技術(shù)檢測(cè)了鹽度脅迫下,三疣梭子蟹鰓中 HSP60蛋白隨脅迫時(shí)間的表達(dá)情況。結(jié)果顯示:10‰、40‰鹽度脅迫后,三疣梭子蟹 HSP60蛋白表達(dá)量在前24hr基本穩(wěn)定,48hr表達(dá)量增加,之后表達(dá)量保持不變。利用半定量 RT-PCR技術(shù)檢測(cè)鹽度脅迫下,三疣梭子蟹鰓中 HSP90基因隨脅迫時(shí)間的表達(dá)情況。10‰鹽度實(shí)驗(yàn)組的三疣梭子蟹鰓 hsp90α mRNA表達(dá)量逐漸減少(p<0.05),120hr最低值約為脅迫前水平0.12倍,

7、而40‰鹽度實(shí)驗(yàn)組的hsp90α mRNA表達(dá)水平先上調(diào)后下降。40‰高鹽脅迫12hr時(shí) HSP90α mRNA表達(dá)量稍有減少,隨后在24hr時(shí)上調(diào)到最大值,約為脅迫前水平1.21倍,之后逐步下降,在120hr時(shí)達(dá)到最低值,約為0.22倍。
　　為證明三疣梭子蟹 HSP90α蛋白與鹽度脅迫的相關(guān)性,我們根據(jù) GenBank上提供的三疣梭子蟹 HSP90α基因蛋白編碼區(qū)序列,構(gòu)建 pET28-HSP90α原核表達(dá)重組質(zhì)粒在大腸桿菌

8、DE3(BL21)中進(jìn)行鹽度脅迫表達(dá)。結(jié)果顯示:重組質(zhì)粒的大腸桿菌生存率明顯高于轉(zhuǎn)空載體的大腸桿菌,在越接近大腸桿菌鹽度耐受極限值時(shí),兩者差異越顯著,在鹽度脅迫最高值(1050 mmol/L)下,兩者差異達(dá)到10.7倍。這說(shuō)明在鹽度脅迫下三疣梭子蟹 HSP90α對(duì)大腸桿菌有保護(hù)作用,能顯著提高大腸桿菌對(duì)鹽度脅迫的耐受力。
　　總結(jié)來(lái)看,鹽度脅迫下,三疣梭子蟹 HSP60 mRNA和蛋白表達(dá)量均增加;以及鰓中 HSP90α mRNA