結(jié)核分枝桿菌熱休克蛋白Hsp60編碼基因的克隆與原核表達(dá).pdf

1、一、目的 熱休克蛋白(heatshockprotein,Hsp)屬于廣泛存在于自然界中高度保守的蛋白質(zhì)家族，在熱應(yīng)激下它們大量表達(dá)，因此稱為熱休克蛋白。熱休克蛋白表達(dá)量的提高與許多應(yīng)激條件有關(guān)，如低氧、營養(yǎng)缺乏、病毒感染、吞噬和轉(zhuǎn)化作用。結(jié)核分枝桿菌是結(jié)核病病原菌。結(jié)核分枝桿菌基因組攜帶有兩組GroEL基因，GroEL1和GroEL2。它們分別編碼熱休克蛋白60(cpn60.1)和熱休克蛋白65(cpn60.2)。當(dāng)機(jī)體感染結(jié)核

2、分枝桿菌時(shí)，結(jié)核桿菌熱休克蛋白60顯示較強(qiáng)的疫原性，可誘導(dǎo)較強(qiáng)的B細(xì)胞和T細(xì)胞免疫應(yīng)答。因此我們克隆結(jié)核分枝桿菌熱休克蛋白60(Hsp60)編碼基因，并在大腸桿菌中表達(dá)，為進(jìn)一步純化和研究該蛋白的免疫學(xué)特性奠定基礎(chǔ)。 二、方法 利用PCR技術(shù)從結(jié)核桿菌H37Rv株中擴(kuò)增hsp60基因，并將其與pZero-T載體連接，進(jìn)行DNA測(cè)序。用EcoRI+XbaI雙酶切，從TBhsp60-pZero-T質(zhì)粒上切下hsp60基因，然

3、后將該片段插入同樣經(jīng)過雙酶切的E.coli表達(dá)載體pProEXHTb中。構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒pProEXHTb-TBhsp60。并將pProEXHTb-TBhsp60重組原核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入不同的E.coli菌株(BL21，DH5α，JM109)，用不同摩爾濃度的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。 三、結(jié)果 成功地克隆了結(jié)核分枝桿菌hsp60基因。DNA測(cè)序證實(shí)，與GenBank公布的序列一致。含pProEXHTb-TBhsp60基因表達(dá)