結(jié)核分枝桿菌冷休克蛋白CspA的克隆、表達和性質(zhì)研究.pdf

1、冷休克蛋白是廣泛存在于各種微生物中的應(yīng)激蛋白，能夠增強細胞抵御冷激脅迫的能力，它屬于分子伴侶家族成員，結(jié)構(gòu)上富含芳香族氨基酸，通過結(jié)合單鏈核酸從而調(diào)控蛋白表達。大腸桿菌CspA家族是研究最早最深入的冷休克蛋白，其同源蛋白在嗜溫、嗜冷和嗜熱菌中均大量存在，并與真核生物的Y-box蛋白冷休克結(jié)構(gòu)域同源。近年來，曰益增長的證據(jù)表明，冷休克蛋白尤其CspA對于病原菌致病、傳播以及應(yīng)對宿主免疫系統(tǒng)等起著重要的作用，然而，它們參與免疫和耐藥等的具體

2、機制至今尚未被完全闡明。國內(nèi)外關(guān)于該類蛋白參與致病和藥敏的報道較多集中于金黃色葡萄球菌，在結(jié)核分枝桿菌中的報道僅局限于蛋白的體外免疫研究，最近有報道冷休克蛋白CspA參與大腸桿菌生物膜的形成，而生物膜又與致病菌的抗藥和持續(xù)性感染有密切關(guān)系，因而研究該類蛋白將有利于抗致病菌藥物的開發(fā)。 結(jié)核病的全球流行使得尋找新的藥靶蛋白迫在眉睫，結(jié)核分枝桿菌中的冷休克蛋白CspA，它屬于結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)上清中的濾液蛋白(culture filt

3、rate protein，CFP)，為一種可能的T細胞抗原。根據(jù)NcBI公布的冷休克蛋白CspA基因序列，設(shè)計了一對引物，對結(jié)核分枝桿菌基因組進行PCR擴增，獲得與預(yù)期204bp大小相符的DNA片段，經(jīng)序列測定確認為目的基因。 將該片段克隆至原核表達載體pET32a(+)得到重組質(zhì)粒pCspA-pET32，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG誘導重組蛋白的表達；表達的CspA融合蛋白采用兩種純化方法，一是經(jīng)過Ni<'2+>-

4、Sepharose親合柱對蛋白進行柱層析純化，二是通過對結(jié)核分枝桿菌CspA的重組菌進行專一性粗提硫氧還蛋白的“滲透休克法”和傳統(tǒng)生化蛋白提純方法“硫酸銨沉淀”相結(jié)合來純化，通過滲透休克法得到目的重組蛋白粗提液，后采用20～60％的不同硫酸銨飽和梯度進行鹽析，沉淀CspA，再通過SDS-PAGE電泳分析及紫外吸收法測蛋白含量，發(fā)現(xiàn)滲透休克法結(jié)合30％飽和度的硫酸銨鹽析，CspA沉淀量最大。并且兩種純化方法對比，可見滲透休克結(jié)合硫酸銨純化

5、蛋白的方法其效果接近于柱層析，并且成本較低，適用于工業(yè)生產(chǎn)和規(guī)模化放大。 純化的蛋白通過胰蛋白酶消化法鑒定生物學活性，重組CspA中加入長度為35bp的單鏈DNA，然后在30℃條件下，用胰蛋白酶進行消化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入單鏈DNA的重組蛋白比起未加單鏈DNA的重組蛋白，前者受到胰蛋白酶切割能力明顯減弱，切割的半衰期顯著增加，由此可見，正是結(jié)合了單鏈核酸，才對蛋白起到了保護作用，證明重組蛋白CspA是具有結(jié)合單鏈DNA的分子伴侶活性

6、。研究重組質(zhì)粒pCspA-pET32對宿主菌BL21(DE3)的影響，可知重組蛋白可以增強宿主菌對微量卡那霉素的敏感性。對CspA蛋白進行了相關(guān)結(jié)構(gòu)研究。通過Signal P軟件分析結(jié)核菌CspA，發(fā)現(xiàn)作為結(jié)核菌分泌蛋白，該蛋白卻不含典型的信號肽序列，這點也與文獻報道相符。圓二色譜測定重組CspA的二級結(jié)構(gòu)，并與載體pET32a(+)表達蛋白進行對照，發(fā)現(xiàn)重組蛋白CspA在遠紫外區(qū)域的橢圓率是低于對照載體蛋白，因為CspA的 a-螺旋區(qū)

7、域更短。載體蛋白最高峰值在195 nm處，而重組蛋白CspA卻發(fā)生了紅移，最高峰在197 nm出現(xiàn)，遷移的原因即來源于重組蛋白CspA的反向平行的β-折疊。然而，兩者的圓二色譜圖仍然表現(xiàn)出極大的相似性，由此可見，重組蛋白中新插入的基因表達的蛋白并未顯著影響載體蛋白的二級結(jié)構(gòu)。通過圓二色譜實際測定的結(jié)果也與通過軟件測定的結(jié)果一致。以大腸桿菌的CspA的晶體結(jié)構(gòu)作為模板對照，通過同源建模，得到了結(jié)核菌CspA的三級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)這兩個物種的Cs