Rv0341蛋白在結核分枝桿菌中的表達及其診斷依賴利福平結核分枝桿菌感染結核病的臨床價值研究.pdf

1、背景: 依賴利福平結核分枝桿菌簡稱依R菌(Rifampin-dependent Mycobacteriumtuberculosis)是指某些結核分枝桿菌依賴利福平(Rifampin，RFP/R)生長的現(xiàn)象，是比耐藥性變異更為嚴重的生物現(xiàn)象。依R菌感染的結核患者具有病情重、耐多藥、化療效果差和預后不良的臨床特征，如果此類患者繼續(xù)使用利福平，可導致病情加重，是化療失敗和難治性結核病產(chǎn)生的重要原因之一，因此依R菌結核病的早期診斷對臨床

2、治療及預后有重大意義。 目的:本研究對依R菌中高表達的Rv0341蛋白進行分析，對其編碼基因iniB進行限制性內(nèi)切酶片段多態(tài)性分析(Restriction Fragment Length Polymorphisma，RFLP)。利用基因工程技術克隆表達Rv0341，純化后鑒定重組蛋白的免疫原性和抗原性。建立以重組蛋白Rv0341為靶抗原檢測血清Rv0341抗體的斑點免疫金滲濾試驗(DIGFA)，探討其在依R菌結核病診斷中的臨床價

3、值，為進一步研究開發(fā)依R菌結核病診斷試劑盒提供理論依據(jù)和實驗數(shù)據(jù)。 方法: 1.通過SDS-PAGE、免疫印跡分析Rv0341在結核桿菌R依賴株、耐受株和敏感株中表達的差異，RFLP鑒定Rv0341蛋白編碼基因iniB的多態(tài)性。 2.自結核分枝桿菌H37Rv擴增iniB基因，通過基因重組技術構建于pET22b(+)表達載體，酶切、測序鑒定正確的陽性重組質(zhì)粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)IPTG誘導表達，Ni2+親

4、和層析純化目的蛋白。鑒定其免疫原性和抗原性：以重組Rv0341蛋白免疫家兔，檢測產(chǎn)生Rv0341抗體的效價；典型依R菌肺結核患者(陽性)血清、健康人(陰性)血清分別與重組蛋白進行Western-blot。 3.以重組蛋白Rv0341為靶抗原建立檢測血清Rv0341抗體診斷依R菌結核病的DIGFA法。 4.以上述建立的方法對患者(依R菌、R敏感菌、R耐藥菌感染的結核病患者) 結果: 1.SDS-PAGE、免

5、疫印跡證實Rv0341在依R菌中高表達，表達量與R敏感菌和耐R菌有明顯差異。RFLP證實其編碼基因iniB在不同類型的結核桿菌(R敏感菌、耐R菌、依R菌)中不具有多態(tài)性，是保守基因。 2.成功構建了表達重組蛋白Rv0341的工程菌，經(jīng)超聲破菌、SDS-PAGE、UVP掃描證實重組蛋白表達量約占總蛋白的25％，主要以包涵體形式表達。用N12+親和層析柱對目的蛋白純化，獲得純度為95％的重組蛋白。純化重組蛋白免疫家兔產(chǎn)生了效價≥1：

6、100000的抗Rv0341抗體，與典型依R菌肺結核患者陽性血清發(fā)生反應，表明重組蛋白具有良好的免疫原性及抗原性。 3.建立了以重組蛋白Rv0341為靶抗原的診斷依R菌結核病DIGFA法，該方法具有良好的重復性和穩(wěn)定性。檢測95份結核病患者血清，其診斷依R菌結核病的靈敏度為95.8％，特異性為81.7％，準確度為85.3％。 結論: 1.RFLP結果證實iniB為保守基因，不同菌株Rv0341蛋白表達方面的差異不