結核分枝桿菌L型檢測對結核病診療價值的研究.pdf

1、背景：
　　 進入21世紀后，我國肺結核防治局面依然十分嚴峻。結核病疫情呈現感染率高、患病率高、發(fā)病率高、耐藥率高、死亡率高，結核病控制進程慢等“五高一慢”的特點。結核病疫情農村高于城市、青壯年患病率和死亡比例高，嚴重危害著人民群眾的生命安全。結核分枝桿菌(Mycobacterium Tuberculosis，MTB)L型(L form，L)是結核分枝桿菌抵抗外界環(huán)境和賴以生存的重要形式，可在體內長期存活、生長、繁殖，導致結核病

2、緩慢地進展、惡化、復發(fā)和耐藥。近年來國內外的多項研究結果顯示，菌陰肺結核約占活動性肺結核病的70％，而在菌陰肺結核標本中，MTB-L陽性率約為30％;在耐多藥結核病(MDR-TB)患者中MTB-L陽性率達50％。因此，探索MTB-L檢測方法對確定結核感染的性質和進展，選擇治療策略及其效果評價和判定預后、以及修正預防措施具有非常重要的意義。
　　 目的：
　　 針對當前結核病防控的嚴峻形勢，以及MTB-L生物學特性和致病性

3、特點，本研究擬系統分析深圳市羅湖轄區(qū)結核病感染及耐藥狀況，建立快速簡便、靈敏度高、特異度好的MTB-L的涂片染色和培養(yǎng)藥敏的檢測方法，并探討其對結核病診療的臨床價值。
　　 內容：
　　 本研究擬開展以下工作:
　　 ①建立快速簡便、靈敏度高、特異度好的MTB-L的涂片染色和培養(yǎng)藥敏的檢測方法，并進行方法學評價。
　　 ②采用改進的MTB-L涂片染色方法對深圳市羅湖區(qū)慢性病防治院2010年1月至2011年

4、12月期間結核病門診收治的960例結核病確診患者及其治療期間的痰標本同時進行MTB和MTB-L涂片染色檢查。
　　 ③采用改進的MTB-L藥敏培養(yǎng)方法對上述痰標本進行MTB-L培養(yǎng)及藥敏分析。
　　 ④采用羅氏藥敏培養(yǎng)基對上述痰標本進行MTB培養(yǎng)及藥敏分析。
　　 ⑤分析深圳市羅湖轄區(qū)結核病流行現狀，MTB和MTB-L的耐藥情況，以及其對結核病臨床診斷和治療預后的影響。
　　 方法：
　　 1 M

5、TB-L涂片染色方法的改進及其方法學評價
　　 1.1 Zieh1-Neelsen(Z-N)抗酸染色法[5]
　　 ①涂片:收集病例，按《結核病診斷細菌學檢驗規(guī)程》要求，挑取痰標本中干酪樣、膿樣或可疑部分約0.05～0.1 ml，于玻片正面右側2/3處，均勻涂抹成10mm×20mm的卵圓形痰膜，痰膜朝上靜置自然干燥，每位病人涂片2張。
　　 ②染色:玻片經火焰固定后，滴加石碳酸復紅染液蓋滿痰膜，在火焰高處徐徐加熱

6、，切勿沸騰，出現蒸汽即暫時離開，若染液蒸發(fā)減少，應再加染液，以免干涸，加熱3～5 min，待標本冷卻后流水自玻片一端輕緩沖洗，洗去染色液，瀝去玻片上剩余的水。自痰膜上端外緣滴加3％鹽酸酒精，流過痰膜，需脫至痰膜無可視紅色為止，脫色應單片進行。流水自玻片一端輕緩沖洗，沖去脫色液，瀝去玻片上剩余的水。滴加亞甲藍復染液，染色30 s。流水自玻片一端輕緩沖洗，沖去復染液，瀝去標本上剩余的水。
　　 ③鏡檢:待玻片干燥后鏡檢，記錄結果。<

7、br>　　 1.2 改良IK抗酸染色法
　　 ①涂片:收集病例，按《結核病診斷細菌學檢驗規(guī)程》要求，挑取痰標本中干酪樣、膿樣或可疑部分約0.05～0.1 ml，于玻片正面右側2/3處，均勻涂抹成10mm×20mm的卵圓形痰膜，痰膜朝上靜置自然干燥，每位病人涂片2張。
　　 ②染色:涂片于空氣中自然干燥后，丙酮固定;玻片傾斜，蒸餾水自一端流下清洗。加苯酚品紅液后置濕盒內，于室溫24 h后細流水洗。自痰膜上端外緣滴加0.5

8、％鹽酸乙醇脫色劑，脫至無紅色為止。加復染劑亞甲藍，復染0.5～2min，水洗后干燥。
　　 ③鏡檢:待玻片干燥后鏡檢，鏡檢方法、結果判斷和分級報告標準同Zieh1-Neelsen抗酸染色法。
　　 1.3 本研究改進的MTB-L抗酸染色法（以下簡稱“MTB-L抗酸染色法”）
　　 ①涂片:收集病例，按《結核病診斷細菌學檢驗規(guī)程》要求，挑取痰標本中干酪樣、膿樣或可疑部分約0.05～0.1 ml，于玻片正面右側2/3

9、處，均勻涂抹成10mm×20mm的卵圓形痰膜，痰膜朝上靜置自然干燥，每位病人涂片2張。
　　 ②染色:玻片經火焰固定后，滴加石碳酸復紅染液蓋滿痰膜，然后加滴2～3滴雙氧水，混勻，保持染色1～2 min。流水自玻片一端輕緩沖洗，洗去染色液，瀝去玻片上剩余的水。自痰膜上端外緣滴加3％鹽酸酒精，流過痰膜，需脫至痰膜無可視紅色為止，脫色應單片進行。流水自玻片一端輕緩沖洗，沖去脫色液，瀝去玻片上剩余的水。滴加亞甲藍復染液，染色30s。流水

10、自玻片一端輕緩沖洗，沖去復染液，瀝去標本上剩余的水。
　　 ③鏡檢:待玻片干燥后鏡檢，鏡檢方法、結果判斷和分級報告標準同Zieh1-Neelsen抗酸染色法。本改良方法染色合格的玻片呈亮藍色，且放置于報紙上可透過痰膜分辨報紙上的文字。
　　 1.4 熒光定量PCR法
　　 ①DNA提取:收集樣本，按試劑說明書要求處理樣本，提取DNA;
　　 ②PCR擴增:按試劑說明書要求進行熒光定量PCR擴增檢測;

11、>　　 ③結果分析:分析擴增曲線，判定結果。
　　 1.5 方法學評價取經我院肺科門診確診的活動性肺結核患者100例和健康體檢者20例的痰標本，分別采用熒光定量PCR法、MTB-L抗酸染色法、Z-N抗酸染色法，以及改良IK抗酸染色法進行檢測，計算并評估熒光定量PCR法、MTB-L抗酸染色法、Z-N抗酸染色法和改良IK抗酸染色法的特異度、靈敏度、試驗總有效率等指標;分別比較熒光定量PCR法MTB-L陽性檢出率與后三種方法MTB-

12、L陽性檢出率的差異。
　　 2.改進的MTB-L涂片染色法的臨床應用采用MTB-L抗酸染色法對深圳市羅湖區(qū)慢性病防治院2010年1月至2011年12月期間結核病門診收治的960例結核病確診患者及其治療期間的痰標本同時進行MTB和MTB-L涂片染色檢查，分析深圳市羅湖轄區(qū)結核病流行現狀，MTB和MTB-L的感染情況，以及其對結核病臨床診斷和治療預后（陰轉率）的影響。
　　 3.MTB-L培養(yǎng)基的改進及其方法學評價
　

13、　 3.1 羅氏培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)法[8]收集肺結核確診病人痰樣本，采用堿處理法進行前處理，痰液中加4％ NaOH約2～4倍量，振蕩器振蕩1 min后，室溫放置15～20min，其間振蕩2～3次，使痰液化。取前處理消化后痰液0.1 ml，無菌操作接種于羅氏培養(yǎng)基斜面上，每份標本同時接種兩支培養(yǎng)基，放37℃孵育。接種后3～7 d觀察，此后每周觀察一次菌落生長情況，有菌落生長需經抗酸染色確認是否為結核分支扦菌。若至第8周仍無菌落生長可報告陰性

14、結果。
　　 3.2 改良胰胨大豆蛋白胨L型菌培養(yǎng)基(tryptone soybean tryptone ager, TSA-L)培養(yǎng)法[6]收集肺結核確診病人痰樣本，采用堿處理法進行前處理，痰液中加4％ NaOH約2～4倍量，振蕩器振蕩1 min后，室溫放置15～20min，其間振蕩2～3次，使痰液化，再加無菌生理鹽水至約40ml，離心10min，去上清，再用無菌生理鹽水沈一次，余約0.5 ml，取此前處理液0.1 ml，無菌

15、操作接種于改良TSA-L上，均勻涂布后置5％ CO2恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)6周。每周肉眼觀察1次，若有可疑菌落，顯微鏡下觀察菌落形成情況。平板上一般先出現顆粒狀（G型）幼小菌落，由十幾個到數十個球狀體組成。隨時間延長，典型“油煎蛋”狀（L型）菌落逐漸增多。培養(yǎng)時有時亦可見絲狀菌落（F型菌落）。出現菌落時即可涂片抗酸染色鏡檢。無菌落生長者盲刮檢查可提高陽性率。
　　 3.3 本研究改進的MTB-L培養(yǎng)基培養(yǎng)方法（以下簡稱“MTB-

16、L培養(yǎng)基培養(yǎng)法”）
　　 對TSA-L培養(yǎng)基配方進行改進，加入有利于分枝桿菌生長的膽固醇和卵磷脂等特殊營養(yǎng)成分。收集肺結核確診病人痰樣本，采用堿處理法進行前處理，痰液中加4％ NaOH約2～4倍量，振蕩器振蕩1 min后，室溫放置15～20min，其間振蕩2～3次，使痰液化，再加無菌生理鹽水至約40ml，離心10min，去上清，再用無菌生理鹽水洗一次，余約0.5 ml，取此前處理消化后痰液0.1ml，無菌操作接種子改進的MTB-

17、L培養(yǎng)基上，均勻涂布后置5％CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)6周。接種后第3和7日觀察培養(yǎng)情況，此后每周肉眼觀察1次，若有可疑菌落，顯微鏡下觀察菌落形成情況。平板上一般先出現顆粒狀（G型）幼小菌落，由十幾個到數十個球狀體組成。隨時間延長，典型“油煎蛋”狀（L型）菌落逐漸增多。培養(yǎng)時有時亦可見絲狀菌落（F型菌落）。出現菌落時即可涂片抗酸染色鏡檢。無菌落生長者盲刮檢查可提高陽性率。
　　 3.4 方法學評價取50例經熒光定量PCR法確診的M

18、TB-L標本，分別采用羅氏培養(yǎng)基、改良TSA-L培養(yǎng)基和MTB-L培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，比較其培養(yǎng)陽性檢出率及陽性菌落形成所需時間。
　　 4.改進的MTB-L培養(yǎng)基的臨床應用采用MTB-L培養(yǎng)法對深圳市羅湖區(qū)慢性病防治院2010年1月至2011年12月期間收治的960例結核病確診患者及其治療期間MTB-L培養(yǎng)陽性樣本進行4個抗結核病一線藥的藥物敏感試驗，分析MTB-L對4個一線藥品的耐藥情況。
　　 5.MTB藥物敏感試驗采

19、用羅氏藥敏培養(yǎng)基對深圳市羅湖區(qū)慢性病防治院2010年1月至2011年12月期間收治的960例結核病確診患者及其治療期間MTB培養(yǎng)陽性樣本進行4個抗結核病一線藥的藥物敏感試驗，分析MTB對4個一線藥品的耐藥情況。
　　 統計學處理
　　 1.MTB-L抗酸染色法、Z-N抗酸染色法及改良IK抗酸染色法與熒光定量PCR法MTB-L陽性檢出率比較，分別采用配對設計的兩樣本率的卡方檢驗(McNemar配對法)，校正檢驗水準α'=0

20、.05/3=0.017。統計學軟件為SPSS13.0，P＜校正檢驗水準α'為差異有統計學意義。
　　 2.MTB-L抗酸染色法分別與Z-N抗酸染色法、改良IK抗酸染色法的MTB、MTB-L陽性檢出率結果比較采用配對設計的非參數檢驗（McNemar配對法），校正檢驗水準α'=0.05/2=0.025。初治及復治結核病患者治療期間MTB、MTB-L陰轉率比較，均采用成組設計的兩樣本率的卡方檢驗，校正檢驗水準α'=0.05/3=0.0

21、17。統計學軟件為SPSS13.0，P＜校正檢驗水準α'為差異有統計學意義。
　　 3.MTB-L培養(yǎng)基和TAS-L培養(yǎng)基MTB-L培養(yǎng)陽性率檢測結果比較采用配對設計的非參數檢驗（McNemar配對法）;兩種培養(yǎng)法培養(yǎng)MTB-L陽性所需天數采用(x)±s表示，兩者比較采用成組設計t檢驗。統計學軟件為SPSS13.0，P＜0.05為差異有統計學意義。
　　 4.MTB-L培養(yǎng)基培養(yǎng)法和TAS-L培養(yǎng)基培養(yǎng)法的涂陽培陰率比較

22、采用配對設計的非參數檢驗（McNemar配對法），初治及復治結核病患者治療期間MTB、MTB-L耐藥率比較，均采用成組設計的兩樣本率的卡方檢驗。統計學軟件為SPSS13.0，P＜0.05為差異有統計學意義。
　　 結果：
　　 1.熒光定量PCR法、MTB-L抗酸染色法、改良IK抗酸染色法和Z-N抗酸染色法特異度均為100％，熒光定量PCR法、MTB-L抗酸染色法和改良IK抗酸染色法的靈敏度依次為30％、26％和28％，

23、均高于Z-N抗酸染色法(14％)。熒光定量PCR法、MTB-L抗酸染色法和改良IK抗酸染色法的總有效率依次為41.7％、38.3％和40.0％，均高于Z-N抗酸染色法(28.3％)。
　　 2.100例痰標本經熒光定量PCR法、MTB-L抗酸染色法、Z-N抗酸染色法和改良IK法分析，MTB-L陽性檢出率依次為30％、26％、14％和28％。MTB-L抗酸染色法MTB-L陽性檢出率與熒光定量PCR法比較差異無統計學意義(Exact

24、P=0.344＞0.017)，Z-N抗酸染色法MTB-L陽性檢出率顯著低于熒光定量PCR法（Exact P=0.000＜0.017），改良IK法MTB-L陽性檢出率與熒光定量PCR法比較差異無統計學意義（Exact P=0.688＞0.017）
　　 3.2010年度468例結核患者經檢測，MTB-L抗酸染色法MTB、MTB-L陽性檢出率分別為59.0％、26.9％，改良IK抗酸染色法MTB、MTB-L陽性檢出率分別為57.5％

25、、27.6％，Z-N抗酸染色法MTB、MTB-L陽性檢出率分別為38.5％、16.0％。MTB-L抗酸染色法MTB、MTB-L陽性檢出率與改良IK抗酸染色法比較差異均無統計學意義(P=0.092＞0.025; P=0.549＞0.025);MTB-L抗酸染色法MTB、MTB-L陽性檢出率均顯著高于Z-N抗酸染色法，差異均有統計學意義(x2=85.142,P=0.000＜0.025;x2=40.984,P=0.000＜0.025)。

26、>　　 4.2011年度492例結核患者經檢測，MTB-L抗酸染色法MTB、MTB-L陽性檢出率分別為60.8％、27.8％，Z-N抗酸染色法MTB、MTB-L陽性檢出率分別為39.2％、15.4％。MTB-L抗酸染色法MTB、MTB-L陽性檢出率均顯著高于Z-N抗酸染色法，差異均有統計學意義(x2=96.711，P=0.000＜0.025;x2=50.704，P=0.000＜0.025)。
　　 5.2010年1月至2011

27、年12月間初治結核病患者痰液經涂片抗酸染色檢查，MTB陽性患者411例，MTB+MTB-L陽性患者130例，MTB-L陽性患者129例。經規(guī)范化治療5個月后，除1例MTB-L陽性患者外，其余全部轉陰。按《中國結核病防治規(guī)劃實施工作指南》（2008年版）規(guī)范要求計算結核病涂陽患者2、3月末痰菌陰轉率（痰菌陰轉率=某月末累計痰菌陰轉患者數/涂陽患者登記數×100％）。其中MTB陽性患者2、3月末陰轉率均分別高于MTB+MTB-L陽性患者（x

28、2=115.330，P=0.000＜0.017;校正x2=32.889，P=0.000＜0.017）及MTB-L陽性患者（x2=120.031，P=0.000＜0.017;校正x2=33.178，P=0.000＜0.017）;而MTB+MTB-L陽性患者2、3月末陰轉率與MTB-L陽性患者無顯著性差異(x2=0.037，P=0.848＞0.017;x2=0.000，P=0.983＞0.017)。
　　 6.2010年1月至201

29、1年12月間復治結核病患者痰液經涂片抗酸染色檢查，MTB陽性患者12例，MTB+MTB-L陽性患者19例，MTB-L陽性患者13例。經規(guī)范化治療4個月后，除2例MTB+MTB-L陽性患者和1例MTB-L陽性患者外，其余全部轉陰。按《中國結核病防治規(guī)劃實施工作指南》（2008年版）規(guī)范要求計算結核病涂陽患者2、3月末痰菌陰轉率（痰菌陰轉率=某月末累計痰菌陰轉患者數/涂陽患者登記數×100％）。其中MTB陽性患者2月末陰轉率分別略高于MTB

30、+MTB-L陽性患者及MTB-L陽性患者，但無統計學差異(ExactP=0.032＞0.017; Exact P=0.041＞0.017);MTB陽性患者3月末陰轉率分別略高于MTB+MTB-L陽性患者及MTB-L陽性患者，但無統計學差異(Exact P=0.363＞0.017; Exact P=0.593＞0.017); MTB+MTB-L陽性患者2、3月末陰轉率與MTB-L陽性患者均無顯著差異（均exact P=1.000＞0.01

31、7）。
　　 7.50例MTB-L陽性標本在含不同卵磷脂和膽固醇濃度的MTB-L培養(yǎng)基上生長情況不一致，以卵磷脂加入量＞0.6g和膽固醇加入量＞0.6g時生長狀況最佳，因此，卵磷脂和膽固醇的最小加入量均為0.6g。
　　 8.MTB-L培養(yǎng)法MTB-L陽性檢出率為30.6％，改良TAS-L培養(yǎng)法MTB-L陽性檢出率為23.9％，MTB-L培養(yǎng)法MTB-L陽性檢出率顯著高于改良TAS-L培養(yǎng)法(x2=23.077，P=0.

32、000＜0.05)，同時其培養(yǎng)MTB-L陽性所需時間顯著縮短（t=14.851，P=0.000＜0.05）。
　　 9.分別采用改良TAS-L培養(yǎng)法和MTB-L培養(yǎng)法對281例涂片染色MTB-L陽性標本進行分離培養(yǎng)，兩種方法涂陽培陰率[涂陽培陰率=（涂陽培陰例數/涂陽總例數）×100％]分別為9.3％和1.8％，MTB-L培養(yǎng)法涂陽培陰率顯著低于改良TAS-L培養(yǎng)法（P=0.000＜0.05）。
　　 10.深圳市羅湖轄

33、區(qū)MTB初治耐藥率為22.4％，其中單耐藥率為:INH4.7％、RFP3.3％、EB1.7％、SM5.8％，多耐率為3.4％，耐多藥率為3.7％;復治耐藥率為33.3％，其中單耐藥率為:INH5.6％、RFP5.6％、SM5.6％，多耐率為5.6％，耐多藥率為11.1％。初治結核病患者治療2月末結核分枝桿菌耐藥率為61.5％，其中單耐藥率為∷INH23.1％、RFP5.1％、EB12.8％、SM10.2％，多耐率為5.1％，耐多藥率為5

34、.1％;復治結核病患者治療2月末結核分枝桿菌耐藥率為40％，其中單耐藥率為: INH20％，多耐率為20％，耐多藥率為13.6％。
　　 11.深圳市羅湖轄區(qū)MTB-L初治耐藥率為46.7％，其中單耐藥率為:INH11.9％、RFP1.2％、EB11.0％、SM2.0％，多耐率為16.3％，耐多藥率為4.5％;復治耐藥率為46.7％，其中單耐藥率為:INH10.0％、EB10.0％、SM3.3％，多耐率為16.7％，耐多藥率為6

35、.7％。初治結核病患者治療2月末結核分枝桿菌耐藥率為46.6％，其中單耐藥率為:INH11.6％、RFP1.0％、SM1.9％，多耐率為17.5％，耐多藥率為3.9％;復治結核病患者治療2月末結核分枝桿菌耐藥率為50％，其中單耐藥率為:INH16.7％，EB16.7％，多耐率為8.3％，耐多藥率為8.3％。
　　 12.深圳市羅湖轄區(qū)MTB-L初治始耐藥率(46.7％)顯著高于MTB初治始耐藥率(22.5％)(x2=47.148

36、，P=0.000＜0.05)，MTB-L復治耐藥率(46.7％)略高于MTB復治耐藥率(33.3％)，但無統計學差異（x2=0.823，P=0.364＞0.05）。結果提示MTB-L的存在與耐藥嚴重程度密切相關。
　　 結論：
　　 1.本研究改進的MTB-L抗酸染色方法具有良好的靈敏度、特異度，操作簡便易行，適合于痰MTB-L常規(guī)檢測，能夠在基層結核病實驗室推廣應用。
　　 2.本研究改進的MTB-L培養(yǎng)基配方

37、簡單、成本低廉，培養(yǎng)MTB-L所需時間短且細菌生長良好，適合MTB-L培養(yǎng)鑒定及其藥物敏感試驗，能夠在基層結核病實驗室推廣應用。
　　 3.本轄區(qū)初治和復治結核病患者中痰MTB陽性者轉陰率高于MTB+MTB-L陽性者及MTB-L陽性者，MTB+MTB-L陽性者和MTB-L陽性者轉陰率無明顯差異。結果表明MTB-L是結核病患者陰轉率低的重要原因，因此加強結核病患者痰MTB-L的檢測是當前結核病防控的重要策略。
　　 4.深

38、圳市羅湖轄區(qū)MTB-L初治耐藥率和復治耐藥率均為46.7％，結果表明本轄區(qū)MTB-L耐藥形勢依然嚴峻，因此有必要加強結核病患者MTB-L的耐藥性監(jiān)測。
　　 5.深圳市羅湖轄區(qū)MTB初治耐藥率為22.5％，復治耐藥率為33.3％，較2010年第5次全國結核病流行病學抽樣調查初始耐藥率42.7％，復治耐藥率38.5％的水平低，結果表明深圳市羅湖轄區(qū)結核病防控維持在一個良好的水平。
　　 6.深圳市羅湖轄區(qū)MTB-L初治耐藥