探索分枝桿菌噬菌體應(yīng)用于結(jié)核病治療的潛力.pdf

1、目的:
　　目前結(jié)核病疫情仍相當(dāng)嚴(yán)峻，化療療程過(guò)長(zhǎng)和結(jié)核菌耐藥是當(dāng)前急待解決的兩大主要難題。國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)部分分枝桿菌噬菌體能有效裂解結(jié)核菌標(biāo)準(zhǔn)株，甚至耐藥的結(jié)核菌，而雞尾酒制劑抗結(jié)核的效果更好，還能延緩結(jié)核菌對(duì)噬菌體產(chǎn)生抗性。同時(shí)也有研究發(fā)現(xiàn)尾部卷尺蛋白含motif3基序的分枝桿菌噬菌體能有效感染靜止期的恥垢分枝桿菌，且motif3具有復(fù)蘇促進(jìn)因子類似的水解肽聚糖的作用。故本實(shí)驗(yàn)首先是繼續(xù)篩選能作為分枝桿菌噬菌體雞尾酒制劑配方的

2、噬菌體，同時(shí)也進(jìn)一步明確尾部卷尺蛋白含motif3基序的分枝桿菌噬菌體能否復(fù)蘇休眠的結(jié)核菌。
　　方法:
　　1分枝桿菌噬菌體Bo4抗結(jié)核潛力研究
　　1.1分枝桿菌噬菌體Bo4裂解不同pH值7H9固體培養(yǎng)基上恥垢分枝桿菌mc2155能力的比較。
　　1.2體外研究分枝桿菌噬菌體Bo4阻止結(jié)核菌生長(zhǎng)的能力，結(jié)果使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　2分枝桿菌噬菌體Bo4基因組生物信息學(xué)分析

3、　　2.1采用EditSeq軟件分析基因組的一般特點(diǎn):①應(yīng)用DNAStar軟件包中Editseq分析基因組大小及GC含量。②應(yīng)用TRF軟件推測(cè)Bo4基因組中可能的串聯(lián)重復(fù)序列。③應(yīng)用tRNAscan軟件預(yù)測(cè)Bo4基因組中可能的tRNA區(qū)域。
　　2.2采用Glimmer3.0軟件進(jìn)行基因預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)分枝桿菌噬菌體Bo4的編碼區(qū)域。
　　2.3將分枝桿菌噬菌體Bo4核苷酸序列與數(shù)據(jù)庫(kù)的核苷酸序列做Blast分析對(duì)比，并將分析對(duì)比

4、最好的結(jié)果制作成點(diǎn)陣圖。
　　2.4將分枝桿菌噬菌體Bo4基因與數(shù)據(jù)庫(kù)基因進(jìn)行Blast m8比對(duì)，將比較的最好結(jié)果生成svg的共線性圖。
　　2.5分枝桿菌噬菌體Bo4與其他6株G簇分枝桿菌噬菌體序列兩兩比對(duì)，采用鄰接法，最后用tree view軟件生成進(jìn)化樹圖。
　　3分枝桿菌噬菌體TM4促使結(jié)核休眠菌復(fù)蘇的初步探索
　　3.1采用密閉培養(yǎng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv構(gòu)建結(jié)核休眠菌模型。
　

5、　3.2采用藥敏檢測(cè)、直接培養(yǎng)法和電鏡觀察作為結(jié)核休眠菌模型的檢測(cè)方法。
　　3.3采用雙層固體培養(yǎng)基法擴(kuò)增分枝桿菌噬菌體TM4及采用小平板法測(cè)定噬菌體TM4滴度。
　　3.3采用肉眼觀察、菌落計(jì)數(shù)和電鏡觀察作為結(jié)核休眠菌復(fù)蘇的檢測(cè)指標(biāo)。
　　結(jié)果:
　　1分枝桿菌噬菌體Bo4抗結(jié)核潛力研究
　　1.1分枝桿菌噬菌體Bo4裂解不同pH值7H9固體培養(yǎng)基上恥垢分枝桿菌mc2155能力的比較。
　　1.2

6、分枝桿菌噬菌體Bo4感染組與空白對(duì)照組比較，在分別培養(yǎng)1天、3天及5天后，兩組結(jié)核菌量均有明顯差異，說(shuō)明分枝桿菌噬菌體Bo4能有效裂解結(jié)核菌，阻止其生長(zhǎng)。
　　2分枝桿菌噬菌體Bo4基因組生物信息學(xué)分析
　　2.1分枝桿菌噬菌體Bo4基因組大小為39318bp，GC含量為66.76％。通過(guò)TRF軟件在噬菌體Bo4基因組中未找到串聯(lián)重復(fù)序列。通過(guò)tRNAscan軟件在噬菌體Bo4基因組中未找到tRNA。
　　2.2根據(jù)G

7、limmer3.0軟件分析，共預(yù)測(cè)出58個(gè)推測(cè)基因，對(duì)這些基因逐個(gè)進(jìn)行同源檢索分析，得到19個(gè)已知功能的基因，35個(gè)基因與未知功能的基因有同源性，4個(gè)基因未找到同源性基因。通過(guò)生物學(xué)信息分析在分枝桿菌噬菌體Bo4基因組中未發(fā)現(xiàn)有毒基因。
　　2.3分枝桿菌噬菌體Bo4基因組的58個(gè)基因中只有4個(gè)基因與BPs和Angel無(wú)同源性，相似度達(dá)93.10％，共線性清晰，所以我們推測(cè)Bo4屬于G簇分枝桿菌噬菌體，并且基因組是雙鏈線性DNA。

8、
　　2.4分枝桿菌噬菌體Bo4核苷酸序列與數(shù)據(jù)庫(kù)核苷酸序列比較分析發(fā)現(xiàn)，其與目前已經(jīng)測(cè)序的6株G簇分枝桿菌噬菌體核苷酸序列相似性均較高（平均相似性＞90％），也證明分枝桿菌噬菌體Bo4屬于G簇分枝桿菌噬菌體。
　　2.5從系統(tǒng)發(fā)育樹分析可知距離越近的噬菌體，親緣關(guān)系越近。分枝桿菌噬菌體Bo4與其他6株G簇分枝桿菌噬菌體核苷酸相似性均較高，系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析發(fā)現(xiàn)其與分枝桿菌噬菌體Legendre的關(guān)系最近。說(shuō)明這兩株分枝桿菌噬菌

9、體具有共同的祖先。
　　3分枝桿菌噬菌體TM4促使結(jié)核休眠菌復(fù)蘇的初步探索
　　3.1結(jié)核休眠菌模型的構(gòu)建及檢測(cè)
　　密閉培養(yǎng)18天的含亞甲藍(lán)的結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv試管變?yōu)闊o(wú)色，說(shuō)明此時(shí)試管已變?yōu)槿毖?。密閉培養(yǎng)50天還有部分結(jié)核菌可培養(yǎng)，未完全進(jìn)入休眠菌狀態(tài)。密閉培養(yǎng)93天的模型液接種在羅培養(yǎng)基上無(wú)菌落生長(zhǎng)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv和密閉培養(yǎng)120天的結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv行電鏡觀察，見

10、密閉培養(yǎng)120天的結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv的細(xì)胞壁比對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv的細(xì)胞壁厚，交聯(lián)更緊密。
　　3.2噬菌體液的制備
　　按照雙層固體培養(yǎng)法擴(kuò)增分枝桿菌噬菌體TM4，直接刮取上層培養(yǎng)基收集噬菌體液及采用小平板法測(cè)噬菌體TM4滴度，測(cè)定為2.1×1010PFU/mL。
　　3.3復(fù)蘇休眠菌
　　3.3.1肉眼觀察培養(yǎng)3天Rpf E組管底菌量多于其余組;培養(yǎng)8天噬菌體TM4組管底菌量多余

11、空白組;后續(xù)觀察見TM4組及Rpf E組管底菌量較前均有增加，培養(yǎng)上清液明顯變黃，空白組與之前比較也稍有增加。
　　3.3.2混合液培養(yǎng)1天時(shí)三組菌落計(jì)數(shù)均是0 CFU/m;培養(yǎng)6天時(shí)，空白組、TM4組和Rpf E組的菌落計(jì)數(shù)分別是0 CFU/mL、0.7×102CFU/mL和2×104CFU/mL;培養(yǎng)14天時(shí)，空白組、TM4組和Rpf E組的菌落計(jì)數(shù)分別是3.4×101CFU/mL、1.68×107 CFU/mL和2.1×10

12、9CFU/mL。
　　3.3.3電鏡觀察培養(yǎng)17天混合物TM4組有大量薄壁結(jié)核菌、部分厚壁且交聯(lián)緊密的結(jié)核休眠菌和結(jié)核菌細(xì)胞碎片;Rpf E組滿視野薄壁的結(jié)核菌;空白組含大量厚壁的結(jié)核休眠菌和少數(shù)薄壁結(jié)核菌。
　　結(jié)論:
　　分枝桿菌噬菌體Bo4能有效阻止體外結(jié)核菌的生長(zhǎng)，基因組生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)其是一株不含有毒基因的裂解性噬菌體，滿足作為分枝桿菌噬菌體雞尾酒制劑配方噬菌體的安全性要求。分枝桿菌噬菌體TM4能有效感染結(jié)