GLS-IL-12重組恥垢分枝桿菌對小鼠結核病的治療作用.pdf

1、國內外研究背景： 1．結核病位居單一病原體引起病人死亡的嚴重傳染病之首。耐多藥菌株的流行、合并HIV感染、化療時間較長等是目前阻礙結核病防治工作的幾大障礙。 2．傳統(tǒng)疫苗主要用于疾病的預防，而近幾年發(fā)展較快的治療性疫苗可通過加強或調整患者的免疫功能達到治療目的，特別是對一些慢性感染性疾病的治療。目前結核病治療性疫苗的研究主要集中在DNA疫苗、滅活分枝桿菌疫苗和活疫苗等幾個方面。 3．結核分枝桿菌是一種胞內寄生菌，

2、巨噬細胞首先發(fā)揮抗結核分枝桿菌作用。Th1型免疫應答在抗結核分枝桿菌感染過程中有重要的保護作用。IL-12是重要的免疫調節(jié)分子，主要誘導Th1型細胞免疫應答。 4．GLS是人NK細胞和CTL細胞產生的一種天然抗菌肽，具有抗多種微生物和腫瘤的活性。血清GLS水平和宿主的細胞免疫應答密切相關。GLS可直接殺滅細胞外的Mtb，通過改變細胞膜的完整性，在穿孔素輔助下可進入巨噬細胞中對胞內吞噬的Mtb進行殺傷。 研究目的：

3、 構建可靶向遞送pZM03進入肺泡巨噬細胞進行表達的GLS/IL-12重組恥垢分枝桿菌治療性活疫苗，并從體外細胞水平、活體水平探討其誘導GLS和IL-12 的表達，激發(fā)小鼠抗結核特異性免疫反應的能力；觀察該重組活疫苗對結核分枝桿菌H37Rv感染小鼠的治療作用，并用抗癆藥物及免疫調節(jié)劑．微卡等評估其治療效果。 研究方法： 1．通過分步克隆，分別將GLS基因片段亞克隆入雙啟動子真核共表達質粒pBudCE4.1的HindⅢ/B

4、amHI位點中、鼠單鏈IL-12基因亞克隆入NotI/KpnI位點中、分枝桿菌復制子OriM基因亞克隆入NheI位點中，形成穿梭/共表達質粒pZM03并導入巨噬細胞中進行表達。通過RT-PCR、Westernblot、ELISA、免疫細胞化學等方法從轉錄和翻譯水平對目標基因產物進行檢測。 2．將pZM03質粒電轉化恥垢分枝桿菌標準株．ATCC607，制備GLS/IL-12重組恥垢分枝桿菌，PCR進行鑒定，擴增；洗滌后導入RAW2

5、64.7細胞后作RT-PCR、免疫細胞化學和ELISA對表達產物進行檢測。 3．以pZM03，BCG，ATCC607，重組恥垢分枝桿菌，滅活重組恥垢分枝桿菌，生理鹽水6組滴鼻免疫BALB/c小鼠3次，4周后觀察肺脾病理改變；作抗酸染色了解重組菌的分布；免疫組織化學和RT-PCR檢測GLS、IL-12在組織中的表達；特異性PPD抗原刺激后脾淋巴細胞增殖情況；支氣管灌洗液SIgA、血清IFN-γ、IL-12、IL-4、IgG2a含量

6、測定。 4．刮取改良羅琴氏培養(yǎng)基生長4周的結核分枝桿菌H37Rv標準株，加0.05％Tween80生理鹽水磨菌制成懸液，用菌落計數后以每只小鼠5X10<'4>CFU/50μl滴鼻感染，制作結核分枝桿菌感染模型。 5．結核分枝桿菌H37Rv感染BALB/c小鼠4周后，分別用生理鹽水、恥垢分枝桿菌、pZM03、重組恥垢分枝桿菌治療6次，于第一次治療后3個月，處死小鼠，檢測器官荷菌量、脾淋巴細胞IFN-γ和TNF-α的分泌水平

7、、血清IL-12和IFN-γ、肺泡灌洗液SIgA的水平和肺、脾組織中GLS表達，同時觀察小鼠肺、脾組織病理改變情況。 6．結核分枝桿菌H37Rv感染BALB/c小鼠4周后，分別用生理鹽水、重組恥垢分枝桿菌、抗癆藥(INH+PZA)、重組恥垢分枝桿菌+INH+PZA、微卡+INH+PZA等治療3個月后，通過觀察小鼠肺、脾病理改變及體內免疫狀態(tài)的調整等評估重組疫苗的治療效果。 實驗結果： 1．成功構建了攜帶GLS、小

8、鼠單鏈IL-12、分枝桿菌復制子OriM的穿梭/共表達質粒pZM03，導入巨噬細胞后通過RT-PCR、EIASA、免疫細胞化學等方法從轉錄和翻譯水平都檢測到了目標基因的表達產物。 2．成功得到了靶向性良好的GLS/IL-12重組恥垢分枝桿菌，導入RAW264.7細胞后RT-PCR檢測到了GLS和IL-12的表達。 3．以重組恥垢分枝桿菌滴鼻免疫BALB/c小鼠，4周后肺脾組織無明顯病理改變，免疫組化檢測到GLS的表達，血

9、清IFN-γ、IL-12和IgG2a含量、PPD刺激后脾淋巴細胞培養(yǎng)上清IFN-γ含量較其它對照組明顯增高。 4．結核分枝桿菌H37Rv 5X10<'4>CFU/50μl滴鼻感染小鼠4周后，所有小鼠肺、脾組織中均可見抗酸陽性菌，肺、脾組織可檢測出細菌，肺組織病理改變明顯，正常肺泡結構消失，以充血實變、淋巴細胞、巨噬細胞浸潤為主，增生性改變不明顯，未見明顯的組織壞死。脾組織病理改變主要是巨噬細胞增生。 5．重組恥垢分枝桿菌

10、滴鼻治療12周后，肺組織病變范圍和程度與其它組比較明顯好轉；肺和脾的器官荷菌量也降低；小鼠脾淋巴細胞IFN-μ和TNF-α、血清中IL-12和IFN-γ的分泌水平及支氣管肺泡灌洗液PPD特異SIgA都明顯高于其它組；免疫組化法檢測到小鼠肺和脾組織中GLS的表達。 6．用INH+PZA、重組恥垢分枝桿菌聯合INH+PZA及微卡聯合INH+PZA同時治療12周后，結果顯示：單獨使用重組恥垢分枝桿菌在病理改變、荷菌量降低方面的效果不如

11、INH+PZA，但Th1免疫應答好于INH+PZA；重組恥垢分枝桿菌聯合INH+PZA治療效果優(yōu)于單獨INH+PZA和微卡聯合INH+PZA的治療效果。 結論： 1．人顆粒溶素和小鼠IL-12能在小鼠巨噬細胞中實現共表達； 2．利用恥垢分枝桿菌作為生物體載體廉價、大量克隆并靶向遞送外源治療性基因進入巨噬細胞中表達是可能的； 3．體內外實驗都表明，GLS/IL-12重組恥垢分枝桿菌疫苗具有良好的靶向性，并能