幽門螺桿菌重組恥垢分枝桿菌疫苗的構(gòu)建及作用機理研究.pdf

1、背景和目的：幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，Hp)是慢性胃炎和消化性潰瘍的重要病因，與胃癌和胃MALT淋巴瘤的發(fā)病也有密切關(guān)系。目前臨床上常用的三聯(lián)療法不足以根治Hp感染，甚至導(dǎo)致耐藥菌的不斷增多，費用昂貴，病人依從性差，容易復(fù)發(fā)。免疫接種是徹底消除Hp感染的有效措施，目前Hp疫苗的研究主要為免疫保護抗原加佐劑，但效果仍不夠滿意。研究新的疫苗預(yù)防Hp感染已成為當(dāng)前國內(nèi)外研究的熱點。重組活載體疫苗具有無需純化抗原、無需佐

2、劑、可避免抗原在胃內(nèi)的降解和變性等優(yōu)點，被認為是最有開發(fā)和應(yīng)用前景的疫苗。 卡介苗(BacilleCalmette-Gu6rin,BCG)是理想的重組活載體疫苗。近1O年的研究表明，BCG有諸多不足：(1)難于培養(yǎng)；(2)對多種抗生素有抗藥性；(3)轉(zhuǎn)化率低；(4)對于免疫力低下者，有可能誘發(fā)致命的結(jié)核病。人們期待著基因工程新載體的出現(xiàn)，許多學(xué)者轉(zhuǎn)向非致病分枝桿菌作為載體的研究。 恥垢分枝桿菌(Mycobacterium

3、smegmatis,M．S)是一類快速生長型分枝桿菌，生長快，1～3h繁殖1代，M．S既是一種非致病菌又是一種細胞免疫佐劑，很多外源蛋白能在M．S中表達。這為進一步研究Hp疫苗開辟了新的途徑。 我們的研究是：選擇Hp兩個保守基因UreB和OMPl8分別克隆入大腸桿菌．分枝桿菌穿梭表達載體中，利用電穿孔的方法將表達載體導(dǎo)入M．S中，篩選穩(wěn)定表達的重組M．S菌株；觀察其在小鼠體內(nèi)外的穩(wěn)定性及毒副作用；然后將重組候選疫苗株單獨或聯(lián)合灌

4、胃免疫BALB／c小鼠，在小鼠模型中評價其對Hp感染的免疫保護作用，并對其免疫保護機理進行探討。為尋求安全、有效、廉價的Hp新疫苗打下基礎(chǔ)。 方法： 1．首先，利用hsp70、Mas和p一內(nèi)酰胺酶啟動子作為M．S中調(diào)控外源性基因表達的啟動子，同時利用p一內(nèi)酰胺酶的抗原信號肽作為M．S的外源性基因分泌表達信號肽，并將人HpUreBcDNA和OMPl8cDNA分別克隆入載體，構(gòu)建大腸桿菌一分枝桿菌穿梭分泌表達和非分泌表達載體

5、。利用電穿孔的方法將表達載體導(dǎo)入M．S中，經(jīng)Kan抗性篩選、限制性酶切分析和PCR鑒定及SDS-PAGE和Westernblotting分析，篩選高效表達HpUreB和OMPl8的候選疫苗株。 2．將綠色熒光蛋白質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入構(gòu)建好的重組疫苗中，經(jīng)體外傳代培養(yǎng)和灌胃免疫BALB／c小鼠，以探索重組疫苗體內(nèi)外的穩(wěn)定性和在小鼠體內(nèi)的定植，并對疫苗的安全性進行研究。 3．將重組M．S疫苗(2×107)單獨或聯(lián)合灌胃免疫接種BAL

6、B／c小鼠，同時設(shè)PBS組、M．S空菌組，免疫4w后，各組處死一批小鼠，取血清、胃、脾組織待用；余下的小鼠用HpSSl攻擊2次,4w后處死小鼠，行胃組織快速尿素酶試驗,Hp培養(yǎng)，炎癥程度及其炎癥活動度評分以評價疫苗對胃黏膜Hp感染的免疫保護作用。 4．免疫清除機制探索：攻擊后4w，取血清、胃、脾組織，RT-PCR檢測小鼠胃粘膜和脾組織的Thl細胞因子(INF-7、IL-2、IL-12)與Th2細胞因子(IL-4、IL-6、IL-

7、10)；ELISA檢測Hp特異性血清IgG.IgGl,IgG2a和IgA水平；免疫組化方法檢測胃黏膜固有層IgA表達；MTT檢測淋巴細胞增殖。 結(jié)果：1．設(shè)計了hsp70和Mas引物，采用PCR方法從BCG基因組中擴增出相應(yīng)大小的DNA片段，將目的片段與pMDl8-T載體連接后測序。將測序正確的hsp70和Mas亞克隆入pJEM¨，檢測堿性磷酸酶活性，篩選出高效表達的Mas啟動子和p一內(nèi)酰胺酶啟動子，然后將已測序鑒定的Hp基因U

8、reB和OMPl8連接，構(gòu)建分泌性和非分泌性穿梭表達載體,PCR和酶切鑒定穿梭表達載體構(gòu)建成功。 2．將表達載體利用電穿孔的方法導(dǎo)入M．S中，經(jīng)Kan抗性篩選、限制性酶切分析和PCR鑒定以及SDS-PAGE和Westernblotting證實rM．S株構(gòu)建成功。 3．體外穩(wěn)定性研究結(jié)果表明在有卡那霉素抗性存在的情況下，重組分枝桿菌在體外具有高度穩(wěn)定性，在無選擇性壓力情況下可連續(xù)傳代20次而不發(fā)生質(zhì)粒丟失。應(yīng)用rM．S灌胃

9、免疫Babl／c小鼠后，顯示重組疫苗可較穩(wěn)定地侵入定居于胃、肺、脾臟和肝臟，并且無明顯的毒副作用． 4．各疫苗組Hp定植評分均明顯低于PBS組和空菌組，疫苗組不僅可以降低Yp的定植，而且能減輕Hp造成的小鼠胃黏膜的局部慢性炎癥反應(yīng)，但兩組單價疫苗組比較未見顯著性差異。雙價疫苗組較單價疫苗組更優(yōu)。 5．免疫后BALB／c小鼠特異性抗體顯示rM．S疫苗誘導(dǎo)Hp特異性血清IgG、IgA水平都升高，以IgG2a占優(yōu)勢。用Hp抗原

10、刺激后各免疫組小鼠脾淋巴細胞均有明顯增殖。免疫組化顯示各免疫組小鼠胃黏膜固有層IgA陽性標記腺體數(shù)明顯高于對照組。 6．RT-PCR證實，Hp攻擊之前，各免疫組胃和脾組織已出現(xiàn)IFN-7，IL．12，IL-2表達而無IL-4，IL-6，IL一10表達，PBS對照組胃黏膜和脾組織各細胞因子均無表達；lip攻擊后，PBS和空菌組胃組織出現(xiàn)以Thl細胞INF-~為主的增生，INF-7水平顯著高于疫苗組(P＜O．05)；而三個疫苗組脾臟

11、則出現(xiàn)以Th2細胞(IL-4)為主的增生，IL-4水平顯著高于對照組(P＜0．05)。提示該疫苗的作用機制是誘導(dǎo)Thl／Th2平衡型免疫應(yīng)答。 結(jié)論： 1.成功構(gòu)建了pJMB，pLAB，pLUB和pJMO,pLO,pLAO大腸桿菌一分枝桿菌穿梭質(zhì)粒； 2．重組質(zhì)粒pLAO，pJAB和pLUB在M．S中表達的蛋白可分泌到細菌培養(yǎng)上清中，Westernblotting在細胞培養(yǎng)上清中能檢測到UreB,ompl8。重組

12、質(zhì)粒pJMB和pJMO由于缺乏信號肽，所表達的蛋白以非分泌方式表達。 3．rM．S疫苗經(jīng)灌胃接種BLAB／c小鼠證明能降低Hp定植，減輕胃黏膜的炎癥反應(yīng)，對Hp感染有明顯的預(yù)防保護作用，聯(lián)合免疫組效果更顯著。 4．成功地建立了BALB／c小鼠的Hp感染模型，對rM．S疫苗的免疫保護機理研究結(jié)果顯示，rM．S能產(chǎn)生以Thl細胞和Th2細胞協(xié)同作用的保護性免疫應(yīng)答。 5．rM．S在體內(nèi)外均能穩(wěn)定表達外源蛋白，無明顯毒

13、副作用。 6．綠色熒光蛋白為重組子的篩選和觀測rM．S體內(nèi)定植提供了直觀的手段。 本研究首次將重組分枝桿菌系統(tǒng)用于Hp疫苗的研究，構(gòu)建了含有HpUreB基因和HpOMPl8基因的穿梭表達載體，rM．S免疫接種后可誘發(fā)Thl／Th2平衡型細胞免疫應(yīng)答，He特異性血清IgG、IgA水平都升高。本研究為研制Hp疫苗提供了重要實驗依據(jù)，雖然從基礎(chǔ)實驗過渡到臨床應(yīng)用還有一段距離，但相信隨著研究的不斷深入，重組活載體疫苗在Hp的預(yù)防